BIOTECNOLOGÍA
PCR Y SECUENCIACIÓN DE
ADN
BIOTECNOLOGÍA 2º bachillerato
© Prof. Víctor M. Vitoria (Profesor JANO) – Biología 2º bachillerato
BIOTECNOLOGÍA
SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO DE ADN
ADNs antiguos (Mamut)
Generalmente las muestras suelen ser pequeñas
ADNs escena crimen
se necesita
ADNs embrionarias
ADN genes virales
mediante
AMPLIFICACIÓN
TÉCNICA DE LA PCR
es
Es un proceso repetitivo (desnaturalización,
hibridación, extensión) del que se obtienen
muchas copias de un mismo fragmento de
ADN
(polymerase chain reaction)
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BIOTECNOLOGÍA
TÉCNICA DE LA PCR
Materiales
• Muestra de ADN
• Cebador (P1 y P2)
• Fuente de calor
• Taq polimerasa (resistencia al
calor)
1.
Desnaturalización
por calor.
2.
Hibridación con el
cebador.
3.
Extensión de la
cadena
complementaria por
Taq polimerasa.
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BIOTECNOLOGÍA
Una vez que se tiene cantidad suficiente de ADN…
SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO DE ADN
para fragmentos
no muy grandes
Método del didesoxi
(fragmentos de unos 800 pb)
MATERIALES
Una opción es que cada didesoxinucleótido
tenga una marca fluorescencia de color
diferente. (otra posibilidad es hacer
electroforesis en pozos separados)
Cuando un didesoxinucleótido se une a la cadena en extensión se
detiene la síntesis ya que no se puede unir el siguiente nucleótido al
C3 sin OH
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BIOTECNOLOGÍA
MÉTODO DEL DIDESOXI
Las tres cadenas de ADN son iguales (obtenidas mediante PCR)
Una vez que se tienen todos los materiales y el ADN desnaturalizado, se inicia la síntesis de la hebra
complementaria. Una vez terminada se vuelve a desnaturalizar.
Se presenta lo que sucede a los fragmentos que terminan, por ejemplo, en ddA, es decir, localizan la
posición de una T en el ADN a secuenciar.
(en ese tubo de ensayo sólo
habría ddA)
Se obtienen hebras de ADN
de diferente longitud, todas
ellas terminadas en A. Eso
indica que en esa posición
había una T en el ADN a
secuenciar.
(lo mismo con ddT, ddA, ddC y ddG)
En algunos ADNs, la ddA se unirá a la primera T que
aparece, deteniéndose ahí la síntesis. Será un fragmento
pequeño.
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MÉTODO DEL DIDESOXI
Fragmentos obtenidos según
ADN a secuenciar
¿Cómo se separan los diferentes fragmentos que
Están en el tubo de ensayo?
Por ELECTROFORESIS en GEL de acrilamida
Un solo pozillo
(Los fragmentos más pequeños se desplazan más)
Cuatro pozillos diferentes en
la electroforesis
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MÉTODO DEL DIDESOXI
En el Proyecto Genoma se utilizaron
métodos basados en este sistema pero con
algunas diferencias y, sobre todo,
ordenadores muy potentes.
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