Actividad de los
antimicrobianos frente a las
biocapas bacterianas
Isabel García Luque
Departamento de Microbiología
Universidad de Sevilla
Infecciones asociadas a dispositivos
médicos
 Aumento considerable de dispositivos
médicos. Alta incidencia de infecciones.
 Infecciones persistentes que responden
poco/mal a tratamientos convencionales.
 Resistencia/ tolerancia a los antimicrobianos.
Infecciones asociadas a dispositivos
médicos.
Implante
Catéter intravascular
Sonda uretral
nº /año
Infecciones
Mortalidad
200.000.000
<0,1-7%
15-20%
5.000.000
5-10%
Shunts LCR
80.000
10-15%
Marcapasos
60.000
0-3%
2%
Válvulas protésicas
100.000
1-5%
34%
Prótesis articulares
350.000
<1-2%
2,5%
Implantes dentales
436.000
15%
Infecciones asociadas a dispositivos
médicos
Device
Prevalent causative pathogens
Principal
Secondary
Central venous catheters
CoNS
S. aureus, enterococci, Candida spp., K. pneumoniae, P. aeruginosa.
Urethral catheters
E. coli
Candida spp., CoNS, E. faecalis, P. mirabilis.
Mecanical heart valves
CoNS
S. aureus, Streptococcus spp., GNB, enterococci, diptheroids.
Ventricular assist devices
CoNS
S. aureus, Candida spp., P. aeruginosa.
Coronary stents
Neurosurgical ventriclar shunts
Peritoneal dialysis catheters
Orthopedic prostheses
Fracture-fixation devices
Endotracheal tubes
Inflatable penils implants
Breast implants
Cochlear implants
S. aureus
Staphylococci
S. aureus
Staphylococci
CoNS
Enteric GNB
CoNS
Staphylococci
S. aureus
CoNS, P. aeruginosa, Candida spp.
Streptococcus spp., Corynebacterium, GNB.
P. aeruginosa, other Gram-negative spp., Candida spp.,
S. pneumoniae, Streptococcus spp., P. acnes.
S. aureus, Propionibacterium spp., Corynebacterium,
P. aeruginosa, Streptococcus spp., Staphylococcus spp.
S. aureus, enteric GNB, P. aeruginosa, Serratia spp., fungi.
E. coli, peptostreptococci, C. perfringens, P. acnes.
P. aeruginosa, Streptococcus spp., N. meningitidis, fungi.
¿Cómo actuar?:


Retirada/cambio del dispositivo.
Tratamiento antimicrobiano prolongado
a altas dosis.

Reintervención difícil.
Única opción: tratamiento
antimicrobiano.

Costes elevados

Actividad antimicrobiana –
biocapas bacterianas

Huésped
Microorganismo.
Antimicrobiano.

DISPOSITIVO MÉDICO


Biocapas bacterianas:
Comunidad de microorganismos, incluidos dentro
de una matriz extracelular, que se encuentran
adheridos a una superficie o en una interfase y
que poseen un estado metabólico diferente del de
las bacterias de vida libre.
J.W.Costerton. The Biofilm Primer
Formación de las Biocapas. Adherencia
 Fase inicial: inespecífica, reversible. Interacciones
a larga distancia (>150 nm).
−
−
−
−
−
−
−
−
−
Fuerzas de Van der Waals
Gravitación
Interacciones electrostáticas
Hidrofobicidad
Enlaces de hidrógeno
Enlaces covalentes
Interacciones iónicas
Hidrofobicidad
Moléculas bacterianas
(adhesinas, GPS)
 Fase secundaria: específica, irreversible. Interacciones
a corta distancia (<3 nm).
Formación de las Biocapas.
Una vez adheridas, las bacterias comienzan a multiplicarse hasta que se
desarrolla la biocapa madura.
La estructura de la biocapa no es homogénea.
En el proceso de desarrollo de la
biocapa,
se
establece
una
comunicación entre las bacterias
(quorum sensing).
“Mecanismo bacteriano de comunicación intercelular controlando la
expresión génica en función de la densidad celular”.
Eficacia de los antimicrobianos frente a las
biocapas bacterianas.

Penetrar a través de la densa
matriz de la biocapa.

Mantener su actividad bactericida:
 En las diferentes condiciones
microambientales.
 Frente a bacterias de crecimiento lento.

Presentar baja tasa de desarrollo de resistencias
Resistencia de las biocapas
bacterianasa los antimicrobianos

Resistencia innata.

Mecanismos adicionales, diferentes a los de las
bacterias planctónicas.

CMB biocapas >> CMB planctónicas.

Las bacterias recuperan rápidamente su
sensibilidad cuando se liberan de la biocapa.
Mecanismos de resistencia a los
antimicrobianos en las biocapas bacterianas:

Inadecuada exposición al antimicrobiano
(permeabilidad reducida).

Alteraciones en el metabolismo bacteriano:


Baja tasa de crecimiento

Heterogeneidad fenotípica
Resistencia inducida por los biomateriales
Mecanismos de resistencia a los
antimicrobianos en las biocapas bacterianas:


Inadecuada exposición al antimicrobiano
(permeabilidad reducida).

Pseudomonas aeruginosa: alginato- imipenem y
tobramicina.

Staphylococcus aureus: slime - glicopéptidos.
Actividad dependiente de la estructura /composición
química de la biocapa y tamaño/composición química del
antimicrobiano.
Estudios de Permeabilidad
5
4
1
3
agar. 2,4 Membranas de policarbonato.
3 Biocapas. 5 Disco de antimicrobiano
1 MH
2
Permeabilidad de CIP, AMC, FOS y SXT en
biocapas de P. aeruginosa y E. coli
E. coli
200,0
175,0
150,0
125,0
100,0
75,0
50,0
25,0
0,0
COTRIMOXAZOL
E. coli BLEE+
P. aeruginosa
50%
µg de antimicrobiano
µg de antimicrobiano
FOSFOMICINA
25,0
E. coli
E. coli BLEE+
50%
15,0
10,0
5,0
0,0
1
1
3
P. aeruginosa
20,0
6
3
6
Tiempo en horas
Tiempo en horas
AMOXICILINA-CLAVULANICO
E. coli
5,0
E. coli BLEE+
E. coli
P. aeruginosa
4,0
50%
3,0
2,0
1,0
0,0
1
3
Tiempo en horas
6
µg de
antimicrobiano
µg de antimicrobiano
CIPROFLOXACINO
E. coli BLEE+
P. aeruginosa
30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
50%
1
3
Tiempo en horas
6
Mecanismos de resistencia a los
antimicrobianos en las biocapas bacterianas:

Alteraciones en el metabolismo bacteriano:

•
Tasa de crecimiento reducida:
•
Pseudomonas aeruginosa /betalactámicos.
•
Staphylococcus epidermidis/ ciprofloxacino.
Diferentes condiciones microambientales: ácido/básicas,
aeróbicas/anaeróbicas
•

P. aeruginosa / tobramicina.
Mecanismos convencionales de resistencia a los
antimicrobianos.
Mecanismo de resistencia
Impermeabilidad de las biocapas a
los agentes antimicrobianos
Especies bacterianas
Antimicrobianos
P. aeruginosa
Aminoglucósidos,
Betalactámicos
S. epidermidis
S. aureus
Vancomicina,
Teicoplanina
P. aeruginosa
E. coli
Betalactámicos
S. epidermidis
S. aureus
Fluoroquinolonas
Tasa alterada de crecimiento
El microambiente de las biocapas Característica general de las
Aminoglucósidos,
afecta a la actividad antibacteriana
biocapas
Macrolidos, Tetraciclinas
Mecanismos de resistencia
Azitromicina,
expresados en bacterias
P. aeruginosa
Betalactámicos,
planctónicas
Tobramicina
Elementos genéticos de
transferencia horizontal
Enterobacteriaceae
Betalactámicos,
Aminoglucósidos
Mecanismos de resistencia de las
biocapas bacterianas:
Resistencia inducida por biomateriales:
P. aeruginosa y látex siliconizado:

La actividad de las carbapenemas disminuye en
presencia de este biomaterial.
(J Med Microbiol 1997).

Relacionado con las OMPs (pérdida de oprD2).
(Antimicrob Agents Chemother. 1999)

Inducida por el Zn liberado al medio.
(Antimicrob Agents Chemother. 2003)
OMPs de P. aeruginosa:
Efecto del zinc
MC. Conejo et al.; Antimicrob Agents Chemother. 2003
CzcCBA: Bomba de expulsión responsable de la coresistencia a carbapenemas y metales pesados.
Perron K. et al. J Biol Chem 2004; 279: 8761-8768.
“Comparison of biofilm-associated cell survival following in vitro
exposure of meticillin-resistant Staphylococcus aureus biofilms to the
antibiotics clindamycin, daptomycin, linezolid, tigecycline and
vancomycin”.
Smith et al. Int J Antimicrob Agents. 2009
Limitaciones estudios in vitro:
Formación proceso complejo:
 Muchos factores.
 Difícil reproducir in vitro.
 Resultados controvertidos.
 Cautela a extrapolar in vivo.

Métodos de estudio in vitro
Modelos estáticos:


Formación de las biocapas:

Placas de microdilución.

Incubación de segmentos.
Exposición de la biocapa al antimicrobiano
Ventajas:
Muchos antimicrobianos, diferentes
concentraciones.
Inconvenientes: Modelo estático, tiempos cortos,
poliestireno
MRSA
MSSA
>70%
>75%
MRSE
Efecto de
daptomicina
sobre la
formación de
biocapas
MSSE
70-90%
>90%
VISA
80%
Roveta et al. Int J Antimicrob Agents 2008
Adherencia bacteriana a biomateriales
plásticos
Bacterias adheridas x 105/cm2
Catéter
S. aureus
S. epidermidis
E. coli
P. aeruginosa
Latex siliconizado
27 ±3
18 ±2
19 ±2
24 ±3
PVC
42 ±5
23 ±3
18 ±2
41 ±4
Teflon
11 ±1
7 ±0,4
3 ±0,1
10 ±1
Poliuretano
15 ±1
4 ±0,6
9 ±0,1
13 ±1
Vialon
7 ±1
5 ±0,3
4 ±0,2
11 ±1
López et al. J. Med Microbiol. 1991.
Métodos de estudio in vitro
Modelos dinámicos
Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar.
Dispositivo de Robbins
Modelo dinámico
Sevilla device


Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar.
Utilizar segmentos de catéteres.
Poliuretano. Biocapas de 24 h
Acero inoxidable. Biocapas de 96h.
Actividad de antimicrobianos frente a
microorganismos Gram positivos resistentes
Daptomicina / Biometales

Cepas:



Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 (ica +: productora de
slime).
CMI:
Daptomicina
0.5 mg/L
Vancomicina
2.0 mg/L
Biomateriales:


Segmentos de catéteres de poliuretano (3 cm; 7 french).
Discos de acero inoxidable 316L (diámetro: 8 mm).
Poliuretano. Biocapas de 24 h
1,00E+09
1,00E+08
ufc/cm2
1,00E+07
*
1,00E+06
1,00E+05
*
1,00E+04
1,00E+03
0
24
48
Tiempo (h)
Control
20mg/L Daptomicina
20mg/L Vancomicina
* p<0.05 comparada con vancomicina
Acero inoxidable. Biocapas de 96h.
1,00E+09
ufc/cm2
1,00E+08
1,00E+07
1,00E+06
*
*
1,00E+05
*
1,00E+04
0
24
48
Tiempo (h)
Control
20mg/L Daptomicina
20mg/L Vancomicina
* p<0.05 comparada con Vancomicina
72
Figura 2. Microscopía electrónica de barrido de las biocapas de 72
horas de S. epidermidis sobre catéteres de poliuretano usando el
dispositivo diseñado por nuestro grupo sin antimicrobiano (a) y
expuesto a 7.5mg/L de daptomicina (b)
a)
b)
Linezolid / Biometales
Actividad comparativa de linezolid y vancomicina frente biocapas
bacterianas de 96 horas sobre acero inoxidable a distintos tiempos.
1,00E+10
1,00E+10
ufc/cm2
1,00E+08
1,00E+08
1,00E+06
*
1,00E+06
1,00E+04
1,00E+04
1,00E+02
1,00E+02
0
Control
*
*
*
0
Control
1
1
2
2
Tiempo
Tiempo
(días)(días)
Linezolid+Rifampicina
Linezolid+Rifampicina
3
3
77
Vancomicina+Rifampicina
Vancomicina+Rifampicina
Linezolid / Biometales
Actividad de linezolid y vancomicina asociados a rifampicina frente biocapas
bacterianas de 96 horas sobre acero inoxidable a distintos tiempos.
1,00E+10
ufc/cm2
1,00E+09
1,00E+08
1,00E+10
1,00E+09
*
1,00E+08
1,00E+07
*
*
1,00E+07
*
*
*
1,00E+06 1,00E+06
1,00E+05 1,00E+05
0
0
1
1
2 2(días)
Tiempo
3
3
7 7
Tiem
(días)
Tiem
popo
(días)
Control
Control
Linezolid
Linezolid
Vancomicina
Vancomicina
Nuevas estrategias frente a las
biocapas bacterianas
Impedir la formación de la biocapa:
Bloqueando la adherencia:
Adherencia
BIOMATERIAL
Colonización
Formación
de Biocapa
Adhesión inicial
Adhesina-receptor
Inhibidores del quorum
sensing.
hidrofóbicas

Interacciones

Biomateriales impregnados con biocidas o antimicrobianos.
Moléculas antisentido que silencien los genes involucrados en la
adherencia
Van der Waals

Interacciones electrostáticas

Quorum
Sensing
Nuevas estrategias terapéuticas
frente a las biocapas bacterianas
Eliminar la biocapa formada:


Métodos físicos: corriente eléctrica de baja intensidad,
ultrasonidos
Terapia fotodinámica (PDT)
Efecto del tiempo de incubación con hipericina en la actividad fotodinámica
antimicrobiana frente a biocapas estafilocócicas.
Sofía Ballesta1, Isabel García1, Yolanda Gilaberte2, Antonio Rezusta3, Álvaro Pascual1,4.
Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla1. Unidad de
Dermatología, Hospital San Jorge, Huesca2. Departamento de Microbiología, Hospital Universitario
Miguel Servet. Universidad de Zaragoza. Zaragoza3. Unidad de Enfermedades Infecciosas y
Microbiología Clínica. Hospital Universitario Virgen Macarena. Sevilla 4.
Material y métodos

Cepas:
S. aureus ATCC 29213 y ATCC 33591 (productora y no productora
de slime)
S. epidermidis ATCC 35984 (productora de slime).

Actividad de hipericina (0.04-500 uM):
Bacterias en suspensión: 5 min de preincubación y dosis de luz de 8
J/cm2 (lámpara LED 602±10 nm; intensidad 24 mW/cm2, 10 min tto).
Biocapas de 24 horas formadas sobre placas
de poliestireno:
Diferentes tiempos de preincubación
30 J/cm2 (30 min tto)
Resultados
Bacterias en suspensión:
Preincubación: 5 minutos.
Dosis de luz: 8 J/ cm2
Cinco minutos de preincubación con hipericina 1µM fueron
suficientes para eliminar los estafilococos en suspensión.
Resultados
Biocapas estafilocócicas:
Preincubación: 5 minutos.
Dosis de luz: 8 J/ cm2
1.00E+08
1.00E+07
S aureus no
productor de slime
1.00E+06
S aureus
productor de slime
S epidermidis
UFC / mL
1.00E+05
1.00E+04
S aureus no
productor de slime
1.00E+03
S aureus
productor de slime
1.00E+02
S epidermidis
1.00E+01
1.00E+00
0
0.25 0.5
1
2
4
8
16
Hipericina uM
32
64
125 250 500
S. aureus ATCC 33591
8,00
7,00
Log cfu/well
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
Hypericin µM
20 min
2h
6h
24h
32
64
125
250
Conclusiones

Hipericina mostró un efecto bactericida dosisdependiente frente a las biocapas de S. aureus y S.
epidermidis.

La actividad de Hiperericina frente a las biocapas
de S. aureus y S. epidermidis fue tiempo de
preincubación y concentración dependientes

La reducción en la supervivencia bacteriana fue
menor en la cepa de S. aureus productora de slime
que en la no productora.

El efecto de la hipericina sobre las biocapas de S.
epidermidis fue similar al observado en las biocapas
de S .aureus no productor de slime.
Actividad fotodinámica de hipericina
asociada a antimicrobianos frente a
biocapas de Staphylococcus aureus




Cepas: S. aureus ATCC 29213 y ATCC 33591
(productora y no productora de slime)
Preincubación de las biocapas de 24 horas
formadas sobre placas de poliestireno con hipericina
(0.125-250 µM)
Dosis de luz: 30 J/cm2 (lámpara LED 602±10 nm;
intensidad 24 mW/cm2, 30 min tto).
Incubación durante 24 h con:
10mg/L Linezolid+/- 3 mg/L Rifampicina
*
*
Conclusiones

La actividad fotodinámica de hipericina fue similar a
la mostrada por linezolid solo o asociado a
rifampicina frente a biocapas de S. aureus.

La actividad de hipericina asociada a linezolid o a
linezolid más rifampicina fue mayor que la mostrada
por hipericina sola.
Actividad fotodinámica de hipericina frente
a cepas clínicas de Staphylococcus aureus
Bacterias en
suspensión:
Supervivencia
bacteriana
REDUCCIÓN
3 LOG
REDUCCIÓN
TOTAL
SAMR
11 cepas
SAMS
11 cepas
0,12 µM
0,12 µM
0,12 µM
0,25 µM
Biocapas :
HYP
µM
Supervivencia bacteriana
REDUCCION LOG
MR
MS
2
1,08 ± 0,35
1,05 ± 0,27
4
1,30 ± 0,31
1,09± 0,30
8
1,49 ± 0,42
1,26 ± 0,28
16
1,79 ± 0,47*
1,20 ± 0,30
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