ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE LA BETAÍNA
ALDEHÍDO DESHIDROGENASA
DE ESPINACA
González Segura, Lilian1*, Díaz Sánchez, Ángel G.1, Rudiño Piñera, Enrique2, Mújica Jiménez,
Carlos1 , Montiel, Carmina1 y Muñoz Clares, Rosario A.1
1Departamento
de Bioquímica, Facultad de Química, UNAM, México, D. F., 04510, México. y 2Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos,
Instituto de Biotecnología, UNAM, Cuernavaca, Mor, 62210, México. Correo electrónico: [email protected]
Sitio activo
Introducción
El paso final en la biosíntesis del osmoprotector glicina betaína
en plantas superiores que se lleva a cabo en los cloroplastos
es la oxidación irreversible de betaína aldehído a glicina
betaína en la reacción catalizada por la betaína aldehído
deshidrogenasa (BADH).
CH3
H 3C
H
O
N
+
NAD+
NADH
CH3
-
Lys168
CH3
H 3C
O
N
+
CH3
H+
Glu257
O
Betaína aldehído
El análisis de la estructura de la SpBADH nos llevó a proponer a Wat1
como un buen candidato para ser el agua hidrolítica, debido al gran
volumen del Trp456 que es incompatible con Wat2.
Glu467
NAD+
H2O
La posición del agua 2 (Wat2) es la que más se acerca a la trayectoria de
Bürgi-Dunitz, que es la ideal para que un nucléofilo realice el ataque
nucleofílico sobre el carbono de un carbonilo. Pero esta agua sólo puede
estar presente cuando existe una Val en la posición equivalente a Trp456,
como en la PaBADH. Si el residuo en esta posición es Phe, Trp o His la
molécula de agua no puede colocarse en la posición de Wat2.
Glicina betaína
En plantas como espinaca que acumulan glicina betaína en
respuesta al estrés osmótico producido por sequía, suelos
salinos o bajas temperaturas, los niveles de RNAm, de
proteína y de actividad de BADH se incrementan bajo este
tipo de estrés (1). La BADH de espinaca (SpBADH) es un
dímero con 497 residuos por subunidad. La SpBADH utiliza
como coenzima al NAD+. El mecanismo químico de la
reacción catalizada por las ALDHS involucra 3 pasos
principalmente: 1) el ataque nucleofílico del tiol de la cisteína
catalítica sobre el carbono del aldehído (acilación), el cual
produce un intermediario tiohemiacetal; 2) la transferencia del
hidruro del intermediario tiohemiacetal al anillo de piridina del
NAD(P)+ que produce un intermediario tioéster y 3) el ataque
nucleofílico de una molécula de agua sobre el tioéster
(desacilación).
El objetivo principal de este trabajo fue obtener la estructura
tridimensional de la SpBADH con el fin de caracterizar
estructuralmente a esta enzima y conocer más a fondo su
mecanismo de reacción y regulación.
Trp456
Transferencia
del hidruro
Parámetros cinéticos y de unión al equilibrio del
NAD(H) de la enzima silvestre y Trp456Val
Cys291
Entrada del
aldehído
Cys450
Figura 3. Acercamiento del sitio activo de la SpBADH mostrando los
residuos catalíticos.
La cisteína catalítica, Cys291, está en la conformación de ataque, que es la
posición adecuada para realizar el ataque nucleofílico sobre el aldehído.
El anillo de nicotinamida del NAD+ se observó dentro del sitio activo en la
posición de “transferencia del hidruro”.
El glutámico catalítico, Glu257 que participa como una base general en la
activación de una molécula de agua hidrolítica, se encontró en una
conformación no observada en ningún otro cristal de una ALDH,
interaccionando con el carbonilo del Trp456. Otro hallazgo novedoso en
esta estructura es el puente de hidrógeno entre el oxígeno de la
carboxiamida y el NE1 del Trp456.
Resultados y discusión
Estadística de la colecta de datos y refinamiento
KA es la Km aparente para el NAD+, KB es la Km aparente para la betaína
aldehído.
La mutación Trp456Val produjo una enzima que tiene una afinidad menor
por NAD(H), medida ésta tanto por estudios de velocidad inicial como por
unión al equilibrio,y por el aldehído, medida por la Km.
Cinética de saturación de la SpBADH
silvestre y Trp456Val
Glu185
69.63 81.30 85.70
78.9, 84.8, 77.9
dos dímeros
47.29-2.25
80071
99.9 (94.58)
6.9 (1.9)
7.4 (38.5)
21.74
25.22
Glu179
A
Arg40
Unión al equilibrio del nucleótido en la
SpBADH silvestre
B
Ala41
Figura 4. Sitio de unión del NAD(P)+. A. PaBADH. B. SpBADH.
Unión al equilibrio del nucleótido en la
SpBADH Trp456Val
En el pánel A se muestra el puente salino del Glu179 con la Arg40 en la
PaBADH, lo cual aleja al carboxilato del 2’ fosfato del NADP+ evitando la
repulsión electrostática entre estos dos grupos (3). Mientras que en la
SpBADH (pánel B) en la posición de la Arg40 se encuentra una Ala, lo cual
no atrae ni estabiliza al Glu185 hacia la conformación observada en la
PaBADH.
dominio
catalítico
Trp161
Val453
Trp456
Cys286
Trp167
Cys291
Efecto isotópico del D2O sobre la kcat de las
enzimas silvestre y Trp456Val
Cys450
Ser447
Betaína
aldehído
Betaína
aldehído
Tyr154
dominio de
oligomerización
Val285
Tyr160
A
Ile290
B
B
A
Figura 5. Sitio de unión de betaína aldehído modelado por docking rígido.
A. PaBADH. B. SpBADH.
Figura 1. Estructura tridimensional de la SpBADH.
A) Monómero. La cisteína catalítica (Cys291) se encuentra
representada en esferas amarillas. B) Dímero.
La topología de la SpBADH es muy similar a la que se ha
descrito para las ALDHS, sólo difiere en el dominio de
oligomerización que tiene dos hebras, en lugar de tres
que tienen las enzimas tetrámericas.
El Trp456 en la SpBADH estabiliza la conformación del Trp167, permitiendo que éste
interaccione con el aldehído, a diferencia de la Val453 de la PaBADH que no fija al
Trp161, por lo que éste no interacciona con el aldehído.
Leu258
A
Glu257
Entrada del
aldehído
Wat1
Vistas
laterales
3.1
3.5
2.9
Wat2
Trp456
SpBADH
ALDH2 (1O01)
PaBADH (2WME)
ALDH3 (1AD3)
BADH de bacalao (1A4S)
SmGAPN (1EUH)
BhALDH (3I44)
TtGAPN (1UXU)
Cys291
En rojo se observan las cargas negativas, en azul las cargas
positivas y en blanco las neutras. Figura 2A. Dímero con la
misma orientación que en la Fig. 1B.
La cavidad central de la intercara entre los monómeros y
los dominios de oligomerización presentan un gran
número de cargas positivas, mientras que la región de
entrada del aldehído está rodeada de cargas negativas.
mutante
H2O kcat (s-1)
3.78
14.33
D2O kcat (s-1)
2.47
7.44
H2O kcat (s-1) /
D2O kcat (s-1)
1.53
1.92
Los resultados anteriores sugieren que el Trp456 podría estar
participando en la colocación de Wat1 y del nucleótido.
Referencias
Entrada del
aldehído
Figura 2. Representación del dímero en superficie
mostrando el potencial electrostático.
silvestre
La mutante Trp456Val mostró un efecto isotópico del solvente sobre
la kcat mayor que el de la enzima silvestre, indicando que el paso de
hidrólisis del intermediario tioéster de la reacción es más limitante
de la velocidad en la enzima mutante que en la silvestre.
B
180
Entrada del
nucleótido
13.1 ± 1.0
27.8 ± 2.0
132.1 ± 22.0
5.24x105
3.96x109
8.0 ± 0.5
0.930 ± 0.05
P1
Estructura tridimensional
Entrada del
nucleótido
3.2 ± 0.2
11 ± 2.0
54 ± 3.0
3.25x105
6.01x109
5.7 ± 0.3
0.32 ± 0.03
NAD+
NADP+
Los datos entre paréntesis corresponden a la faja de alta resolución.
La estructura presentada está en proceso de refinamiento.
dominio de unión
a la coenzima
mutante
Ambos resultados son consecuencia de la pérdida de las
interacciones que hace el Trp456. La mutante posee una kcat cuatro
veces mayor que la enzima silvestre, lo que indica que el paso
limitante de la reacción ha cambiado.
Datos cristalográficos de la SpBADH con NAD+
Grupo espacial
Dimensiones de la celda
a, b, c (Å)
, β,  (grados)
Unidad asimétrica
Intervalo de resolución (Å)
Reflexiones únicas
Integridad (%)
I/(I)
Rmerge (%)
Rwork (%)
Rfree (%)
Vmax (U/mg P)
KA (μM)
KB (μM)
kcat/KA (s-1 M-1)
kcat/KAKB (s-1 M-2)
KdNADH (μM)
KdNAD+ (μM)
silvestre
Figura 6. Posiciones e interacciones de moléculas de agua ordenadas
que han sido propuestas como hidrolíticas en diferentes ALDHS.
Se han propuesto varias moléculas de agua ordenadas en el sitio activo de las
ALDHS que pueden llevar a cabo la hidrólisis del intermediario tioéster. En la
Fig. 6 se presentan dos de estas moléculas de agua. Sin embargo, en la
SpBADH no se observa ninguna de estas dos moléculas de agua, ya que
éstas son estéricamente incompatibles con el NAD+.
1. Weretilnyk, E. A. y Hanson, A. D. (1989) Arch Biochem Biophys, 271, 5663.
2. Valenzuela-Soto, E. M. y Muñoz-Clares, R. A. (1993) J Biol Chem, 268,
23818-23823, and Additions and Corrections, J. Biol. Chem. 269, 4692.
3. González-Segura, L., Rudiño-Pinera, E., Muñoz-Clares, R. A. and
Horjales, E. 2008. (2009) J. Mol. Biol. 385, 542-557.
Agradecimientos
Trabajo financiado por DGAPA (IN204708) y el Consejo Nacional de Ciencia
y Tecnología (101986).
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