© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
BIOTECNOLOGÍA
Ingeniería genética
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
BIOTECNOLOGÍA
• Visión general:
Utilización de los seres vivos para beneficio humano
•
•
Producción de alimentos y bebidas
Obtención de medicamentos
• En la práctica:
La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de
técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten
manipular el genoma de un ser vivo.
•
•
Clonación, mapas genéticos,
Organismos transgénicos, terapia génica
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
INGENIERÍA GENÉTICA
a) Tecnología de ADN recombinante
b) Clonación y expresión de genes
c) Aplicaciones
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
PROCESO…(ADN recombinante)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Fragmentar y aislar el ADN
Unión a vectores.
Introducción en las células.
Clonación
Búsqueda del clon idóneo.
Análisis del ADN clonado: transferencia Southern,
Secuenciación.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
FRAGMENTACIÓN DEL ADN
•
Por endonucleasas
•
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son
enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir
de una secuencia que reconocen.
•
Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen
secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas
direcciones).
•
Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como
un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que
entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo
cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las
enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo
afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
Desarrollo de las inteligencias
de restricción
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
ACCIÓN DE ENDONUCLEASAS
• Generan extremos cohesivos.
• Si se actúa sobre dos ADNs diferentes con la misma endonucleasa,
al juntarlos se unirían espontáneamente.
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
IMÁGENES DE ACCIÓN
ENDONUCLEASAS
ADN
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
EN DETALLE…
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
MAPA DE RESTRICCIÓN
Mapa físico de un segmento de ADN que muestra los lugares de corte
de endonucleasas específicas y la distancia entre pares de bases.
Indica puntos de corte
Se reflejan determinadas
secuencias de nucleótidos.
Permite comparar ADNs y
ver su similitud (detección
de mutaciones)
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
EJERCICIO 1
• Un fragmento lineal de ADN de 7Kb se corta por
separado con dos endonucleasas de restricción y
luego con una mezcla de ambas obteniéndose los
fragmentos indicados a continuación :
Endonucleasa de restricción
Tamaño de los fragmentos (Kb)
EcoRI
3.0 y 4.0
HaeIII
2.0 y 5.0
EcoRI + HaeIII
2.0 , 1.0 y 4.0
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
EJERCICIO 1 - Solución
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
APLICACIÓN MAPA RESTRICCIÓN
• Permite diferencias ADNs de individuos de
diferentes especies.
• POLIMORFISMO DE LONGITUD DE
FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN (RFLP)
(cada individuo tiene diferente colección de
fragmentos para la acción de una misma
colección de endonucleasas)
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
2. UNIÓN A VECTORES
Los vectores son estructuras que permiten introducir
material genético en el interior de otra célula.
• Los vectores deben ser tratados con las mismas
endonucleasas de restricción.
• Luego se produce la unión del vector con el
fragmento de ADN a introducir.
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
PLÁSMIDOS
• Son moléculas de ADN
circular e bacterias.
• Tienen replicación
independiente.
• Además, otros genes
• Facilidad para la
manipulación.
• Porta marcadores
específicos: permiten
diferenciación posteror.
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
IMAGEN DE UNIÓN PLÁSMIDO
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
FAGOS
• Virus que infectan
bacterias (bacteriófagos)
• Transducción: incorporan
material genético del
huesped.
• Al infectar otra célula
(bacteria) introduce el
material del antiguo
huesped.
• Ej. Bacteriofágo o fago l.
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
FAGO LAMBDA
• Un vector ampliamente
usado para crear DNA
recombinante.
• 48,502 pares de bases
de longitud.
• Usualmente un DNA
recombinante de lambda
tiene 80% DNA del vector
y 20% del DNA insertado.
CICLO DE UN VIRUS
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
CÓSMIDOS
• Fragmentos de ADN que llevan un ADN no
propio y el sitio COS. (similares a plásmidos)
• Sitio COS: provoca el empaquetamiento del
ADN.
• Conclusión: permite transportar grandes
cantidades de ADN.
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
OTROS
• Cromosomas artificiales de levadura: YACs
• Retrovirus
• Cromosomas humanos artificiales: HACs
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
RESUMEN VECTORES
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
4. CLONACIÓN
• Sacar copias del ADN que se ha unido al vector.
• Se utiliza un huesped:
– Capacidad de crecimiento rápido.
– No ser dañino o patógeno
– Ser capaz de aceptar el ADN exógeno y que éste
permanezca estable.
– El huésped debe tener enzimas para la replicación
del vector.
• Bacterias: E. coli y B. subtillis.
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
Escherichia coli como vector
• Potencialmente patógeno
• Producción de
endotoxinas.
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
CLONACIÓN EN EUCARIOTAS
• EL más utilizado Saccharomyces cerevisiae.
– Es capaz de recibir plásmidos.
– También YACs (cromosomas artificiales de levadura)
• Cultivos celulares de mamíferos:
– Manejo parecidos a huéspedes bacterianos.
– Ventaja: tienen proceso maduración del ARNm y así
ya es directamente funcional.
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
UTILIZACIÓN
DE YACs
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
5. BÚSQUEDA DEL CLON
IDÓNEO
• Hay muchos tipos de
bacterias transformadas.
• ¿Cuál tiene el fragmento
de ADN exógeno que nos
interesa?
• Se saca réplica en
membrana.
• Se desnaturaliza ADN
con NaOH.
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
5. BÚSQUEDA DEL CLON
IDÓNEO
• Se desnaturaliza el ADN
con NaOH.
• Se añade sonda
radioactiva:
complementaria al gen
que se quiere buscar.
• Se lava el ADN
monohebra (sólo queda
el híbrido)
• Se pone placa
fotográfica.
Desarrollo de las inteligencias
Biblioteca genómica
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
APLICACIÓN MÉDICA OBTENCIÓN
DE LA INSULINA
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
6. IDENTIFICACIÓN DE GENES Southern
• Es un mecanismo mediante el cual se pueden
identificar genes que se encuentren en
fragmentos de restricción.
• Aplicación:
– Diagnóstico de enfermedades
– Huella genética
• Concepto previo: electroforesis
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
ELECTROFORESIS EN GEL
• Gel de Agarosa (polímero
de galactosa)
• Se ponen en “pozitos” en
un extremos los
fragmentos de ADN
• Se somete a un campo
eléctrico (grupos fosfato
son arrastrados al polo +)
• Fragmentos más grandes
emigran menos. Los
pequeños más.
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
MÉTODO SOUTHERN
1. Electroforesis en gel (separación de fragmentos por
tamaño)
2. Desnaturalización (a ADN de cadena sencilla)
3. Transferencia a filtro de nitrocelulosa (los papeles
secantes absorben el tampón y los ADN monohebra se
pegan al filtro)
4. Hibridación con sondas marcadas P32.
5. Eliminación de sondas no unidas.
6. Exposición a la película fotográfica y revelado
7. Identificación de fragmentos
Desarrollo de las inteligencias
VER2
VER
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
AMPLIFICACIÓN PCR
• Objetivo: obtener millones de copias en poco
tiempo de fragmentos de ADN.
• Se basa en el enzima: , obtenida de
Thermobacillus.
• Sólo se necesita conocer la secuencia de los
extremos para fabricar cebadores.
• Tras varios ciclos se forman millones de copias.
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
AMPLIFICACIÓN POR PCR
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
POLIMERASA CHAIN REACTION
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
CADENA DE REACCIÓN DE LA
POLIMERASA - 1
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
PCR 2
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
CICLO DE UN VIRUS
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
SOUTHERN
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
Método southern
Desarrollo de las inteligencias
© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje
•
•
Producción de alimentos y bebidas
Obtención de medicamentos
Desarrollo de las inteligencias
Descargar

Diapositiva 1