Parte III.
Cinética enzimática
CINÉTICA
Es el estudio de las velocidades de las
reacciones, aporta las bases para el
entendimiento de cómo ocurre una reacción.
Mecanismo de la reacción

La descripción de una reacción en
términos de las etapas implicadas y la
velocidad de la reacción se denomina
mecanismo de la reacción.
¿Cuántas etapas están implicadas?
¿Cuál es la etapa más lenta y que, por tanto,
limitaría la velocidad de la reacción total?
La primera clave en cuanto al
comportamiento enzimático lo
aportaron:
V. Henri (1903) y posteriormente L. Michaelis
y Maud L. Menten (1913).



Para explicar la relación observada entre la velocidad
inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0)
Michaelis y Menten propusieron que las reacciones
catalizadas enzimáticamente ocurren en dos
etapas:
En la primera etapa se forma el complejo
enzima-sustrato y
En la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar
a la formación del producto, liberando el enzima
libre
Kcat


En este esquema, k1, k2 y k3 son las
constantes cinéticas individuales de
cada proceso y también reciben el
nombre de constantes
microscópicas de velocidad.
Según esto, podemos afirmar que:



v1 = k1 [E] [S]
v2 = k2 [ES]
v3 = k3 [ES]
[ET] = [E] + [ES]
la concentración total de enzima depende
de la cantidad de enzima libre (E) y
enzima unida al sustrato (ES).
 [ET] es constante a lo largo de la reacción
Como [E] = [ET] - [ES] y
v1 = k1 [E] [S]
 resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

MODELO DEL ESTADO
ESTACIONARIO

Por tanto, la velocidad de formación del
complejo enzima-sustrato (v1) es igual a
la de su disociación (v2+ v3)
v1 = v 2 + v 3
k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

Despejando [ES], queda que:

, siendo


Por lo tanto, en el estado estacionario,
la velocidad de formación del producto
es:
v = v3 = k3 [ES] =
Definición Km

Es la concentración de sustrato
para la cual la velocidad de
reacción es la mitad de la velocidad
máxima. En efecto, si KM = [S], la
ecuación de Michaelis-Menten se reduce
a: v = Vmax/2.
Km y afinidad?


El valor de KM da idea de la afinidad del enzima
por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad del
enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor
afinidad.
KM se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2
y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la
reacción 1 lo forma. Así, si KM es grande, el complejo
ES es inestable pues predomina la tendencia a
destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es
pequeña, el complejo ES es estable, ya que
predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad
hacia el sustrato).
Qué se necesita para medir la
velocidad de reacción enzimática?


Extracto proteico que muchos casos no
proviene de una purificación
exhaustiva o del aislamiento de la
enzima.
La medida se realiza siempre en las
“condiciones óptimas” de pH,
temperatura, presencia de cofactores,
etc, y se utilizan concentraciones
saturantes de sustrato.
Vmax


En condiciones “óptimas” y saturantes
de la enzima, la velocidad de reacción
observada es la velocidad máxima
(Vmax).
La velocidad puede determinarse bien
midiendo la aparición de los productos
o la desaparición de los reactivos.
Reacción que cataliza la lactato
deshidrogenasa

La reducción del piruvato para formar lactato es
reversible y dependiente de la presencia de una
coenzima.
Desarrollo experimental




1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0
10 mM Piruvato de sodio
4 mM NADH
Diluciones apropiadas de enzima.
La actividad de una enzima
tiene unidades de velocidad.
Actividad
 Abs 
m
 * Vol . ensayo  mL  * F
 min 

1
1
 M cm * b cm  * mg proteína


 mmol min
1
mg
1
m: es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min
: es el coeficiente de extinción molecular para el NADH, 6.22 x 103
M-1 cm-1.
b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm
Vensayo: es el volumen total del ensayo.
F: es el factor de dilución para la enzima
Tabla de purificación de
proteínas
T abla 3.2. T abla de purificación de la LD H de m úsculo esquelético de bovino.
Procedim iento
H om ogeneizado
(F1)
Sobrenadante de la
precipitación con
sulfato de am onio
45% (F2)
Precipitado
obtenido de la pp
con sulfato de
am onio 70% (F3)
Prim era Fracción
que salió de la
crom atografía*
(FPA )
Segunda Fracción
que salió de la
crom atografía*
(FPB )
Volum en
de la
fracción
(m L)
Proteína
total en la
fracción
(m g)
A ctividad
enzim ática
(m m ol m in -1 m g -1 )
A ctividad
específica
m m olm in -1 m g -1 to tal
Veces de
purificación
R endim iento
1
100
d e la fracció n
Especificidad vs afinidad
ESPECIFICIDAD. Es la capacidad que tiene una
enzima de discriminar entre posibles sustratos.
AFINIDAD. Estabilidad del complejo ES. Nos
indica la capacidad que tiene la enzima para
formar un complejo con un determinado
sustrado. Kd del complejo ES o Km
Representación de dobles recíprocos
Representación de Eadie-Hofstee
pendiente
Inhibidores



Una de las formas de regulación de la
actividad de una enzima es a través de
moléculas que disminuyen su velocidad de
reacción:
Naturales
Artificiales
Muchos compuestos tóxicos como
antibióticos, pesticidas o herbicidas son
inhibidores de enzimas que son responsables
de reacciones vitales para la célula
Interacción inhibidor-enzima


La interacción de un inhibidor y la enzima
no es siempre la misma, ya que depende
de la naturaleza química del inhibidor así
como de la reacción química que cataliza
la enzima.
Para dilucidar el tipo de interacción entre
ambas moléculas se recurre a determinar
el efecto del inhibidor en las constantes
cinéticas de la enzima.
Inhibidores competitivos.




Son moléculas que tienen una similitud estructural y
química al sustrato de la enzima.
El inhibidor se puede unir al sitio activo de la enzima.
Pero como el inhibidor no es idéntico al sustrato, la
enzima no es capaz de convertir el inhibidor a
producto.
El inhibidor bloquea el sitio activo. El inhibidor y el
sustrato no se encuentran al mismos tiempo en el sitio
activo.
El aumento en la concentración de sustrato reduce la
inhibición.
Inhibidor competitivo

Similaridad estructural
Inhibición competitiva
Diferentes gráficos nos pueden
ayudar a determinar la constante de
inhibición (Ki)
.
Gráficos comparados de la
actividad con y sin inhibidor



En la gráfica de
dobles recíprocos:
No cambio en Vmax
Si cambia Km
Inhibidor no competitivo.


El inhibidor no se une al sitio activo de
la enzima sino a un sitio alejado del sitio
activo y ocasiona un cambio
conformacional en el sitio activo de la
enzima.
Un inhibidor no competitivo puro es
aquel en el que sólo se altera la
capacidad de unir al sustrato.
Inhibidores NO competitivos


La mayoría da una inhibición de tipo
mixta, es decir, no sólo se afecta la
unión del sustrato sino también la
conversión del sustrato a producto.
Los inhibidores mixtos alteran tanto la
Vmax como la Km de la enzima.
INHIBICIÓN NO
COMPETITIVA
PURA
MIXTA
Inhibidor acompetitivo.




Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la
enzima libre, es decir sólo se une al complejo
Enzima-Sustrato.
Lo anterior puede deberse a que la unión del
sustrato expone o crea sitios de acceso o unión
para el inhibidor, en el o fuera del sitio activo.
Una vez que el inhibidor se une la enzima se
previene la formación de producto.
El inhibidor acompetitivo altera la Km de la
enzima.
http://wwwbiol.paisley.ac.uk/kinetics/Chapter_3/contents_c
hap3.html

Diferentes tipos de
efectos de los
inhibidores sobre
los parámetros
cinéticos de las
enzimas
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Parte III. - Bioquimexperimental