J.M. Zúñiga. SPEA.CIC.UGR
Jornadas Armonización. Mayo, 2011
Posibles mecanismos
correctores
 Índices de severidad
 Escalas de invasividad
 Aplicación criterios de PF
 Fichas de supervisión (IBAs)
 Habituación y socialización.
 Técnicas de EA
Refinements are modifications in animal-based procedures that
either decrease pain, distress, and discomfort or increase animal
well-being. Morton (2000).
ILAR Journal V41(2) 2000. Humane Endpoints for Animals Used in Biomedical
Research and Testing. http://dels.nas.edu/ilar/jour_online.asp?id=jour_online
Clasificación de la severidad de los
procedimientos. Directiva, 2011
Los Estados miembros velarán por que
todos los procedimientos se clasifiquen:
"sin recuperación"
 "leves"
 "moderados"
"severos",
Severidad de un
Procedimiento relacionada con:
1. Deprivación y rangos de variables
medibles o cuantificables
2. Conjunto de variables que pueden
causar dolor, ansiedad o
sufrimiento
Muy relacionada con la aplicación de
paliativos
Índice de severidad
 Severidad: baja/Intermedia o alta.Escalas:
Descriptiva simple
Numérica
Analógica visual
Melbourne
Colorado, etc.
Para establecer dolor “agudo”
 Margen discriminación observador valorar dolor.
 Margen relacionado con capacidad para percibirlo
Hombre hasta 20 niveles de dolor desde – a +
Animal < gº sensibilidad. < 10 niveles fiables
Protocolos supervisión
Permiten detectar a los animales que
experimentan dolor o sufrimiento
intenso. Imprescindibles para aplicar
medidas correctoras.
Investigador debe diseñar ficha de
supervisión individualizada antes del
procedimiento, especialmente cuando
dicho procedimiento sea de severidad
media o alta.
¿ Es difícil evaluar el estado?, con un
poco de observación ¡NO!:
 Conocer conducta y apariencia
normal
 Observación de signos clinicos
del estado del animal
Signos claves (ILAR, LASA, FELASA) y
criterios claves (Morton & Grifith, 1985)
Ficha de supervisión
 Peso: menor consumo alimento y crecimiento.
Parámetro >> útil en CRÓNICOS. Pérdidas => 20-25%
 Aspecto:
Piloerección, pelo desordenado, sin brillo
Estrés crónico inhiben acicalamiento
Secreciones oculares o nasales
Restos de diarrea en la región perianal
Aparición halo porfirinas en ojo
(cromodacriorrea).
Posturas anormales antiálgidas y temblores
Protocolos de supervisión:
• Permiten detectar dolor o sufrimiento
• Son imprescindibles.
Aspecto
del animal
Piloerección
•Inhibición de acicalamiento
•Secreciones oculares, nasales o presencia de restos de diarrea
• Halo de porfirinas alrededor del ojo (cromodacriorrea).
•Posturas anormales antiálgidas
•
Comportamiento:
Inactividad y falta de interacción. Tener en cuenta fotoperiodo
Automutilación, convulsiones, disnea y vocalizaciones anormales:
problema grave.
Respuesta a
manipulación
Útil solamente con personal familiarizado
Respuesta excesivamente pasiva como muy agresiva, problema.
Peso del animal:
Variables
clínicas:
Pérdidas => 20-25% son indicativas de falta de bienestar.
Temperatura, frecuencia cardíaca y respiratoria indican estrés o dolor.
•Corticoides en heces
•
RC
END POINT
 Se define como el momento en el cual se
reduce, minimiza o termina el dolor y/o diestrés*
del animal, mediante acciones tales como:
 Eutanasia
Finalizar el procedimiento doloroso
Tratamiento paliativo dolor y/o diestrés.

 El EP debe ser compatible con el experimento.
 *Similar el concepto de sufrimiento
Objetivos para definir un EP:

Realizar las observaciones apropiadas (conducta,
fisiología...)
 Asignar valores a las observaciones realizadas
 Determinar que observaciones son las más
indicadoras de dolor y/o diestrés en la investigación
 Determinar que observaciones pueden predecir mejor
un mayor deterioro del animal para, identificar el punto
mas temprano donde aparecen los síntomas.
 Establecer EP significativo y objetivo
Observaciones apropiadas de los animales
Evaluación del dolor:
 cambios de peso corporal
apariencia física externa
signos clínicos medibles
cambios en la conducta espontánea
respuestas conductuales a estímulos externos
Importante, conocer las características conductuales de la especie,
animal o cepa (los roedores y lagomorfos pueden NO mostrar
muchos cambios conductuales aun cuando sufren dolor).
Protocolo
 Observar al animal sin molestarlo. Ver si
manifiesta conductas normales o anormales y
sus reacciones a estímulos externos
 Examen clínico. Los signos clínicos y las
mediciones se anotan
 Usar tablas de cuantificación estandarizadas
(facilitar recogidas datos).

+ signos de dolor y/o diestrés relacionados con la condición
bajo estudio (se deben usar).
Posibles áreas de deprivación
psicológica o biológica-1
Denegación de:
Alimento / agua
Sueño / Auto limpieza
Privacidad / Espacio vital
Relaciones sociales / Contacto
confortable
Estimulación sensorial
Desfogue de agresividad
Posibles áreas de deprivación
psicológica o biológica-2
Denegación de:
Evitación / Actividad esqueleto muscular
Exploración/Elección
Cambios ejecutables del ambiente
Medioambiente natural o naturalizado
Oportunidad para desarrollar otras
pautas de conducta
Analgésicos frente al dolor
Estudios de toxicología
Me toca bailar con la/el más…
Mayor esfuerzo en Alternativas….
EPAA (Asociación Europea de Enfoques Alternativos)
Public Funding for 3Rs Research
Sobre 12 m €
Reprotect
Sens-it-iv
ACuteTox
OSIRIS
PREDICT-IV
Carcinogenomics
VITROCELLOMICS
INVITROHEART
ESNATS
 NanoTEST
Modelos Animales en Procesos Biológicos
Evaluación preclínica y seguridad de productos
químicos, farmacéuticos, aditivos alimentarios,
cosméticos u otros
 Comportamiento fisiológico/patofisiológico
después del tratamiento con una sustancia
 Efecto farmacológico/tóxico de sustancias
 Concentraciones eficaces de medicamentos
 Efectividad y seguridad de vacunas
 Reacción a materiales/sustancias ajenos
(xenobioticos)
“La Gran carnicería”
Libro Blanco de sustancias químicas que
impulsa la Comisión Europea de MA
La Comisaria de MA de la UE, Margot
Wallström, propone la revisión de 30.000
de los 100.000 productos químicos que
están actualmente en el mercado.
¡OJO! Responsable la industria química
El informe comunitario cifra el coste
económico para la industria en
32.000.106 €
La consultora Mercer Management
Consulting estima que significaría una
pérdida del 1.8% del PIB anual de la UE,
cifras que la industria hace suyas.
Tipos de toxicidad
AGUDA (sin supervivencia): se pueden
mantener un mínimo de horas o días
SUBAGUDA (supervivencia a corto plazo).
CRÓNICA (supervivencia a largo plazo).
medidas de control máximo.
(i) Con observación constante
(ii) con observación ocasional

* Tipo de test (Toxicidad):
Toxicidad Aguda & Sub-aguda, hasta 28 días
Métodos que utilizan letalidad a término
[A]Dosis letal ( LD o LD50 –50% de los animales ensayados-)
[B] Otros métodos letales
[C] Métodos clínicos no letales
Toxicidad Sub-crónica & crónica:
[D] Más de 28 días incluido carcinogénesis
[E]
Teratogenia, Mutagenicidad y Toxicidad Reproductiva
[F]
Irritabilidad Ocular
[G]
Irritabilidad Cutánea
[H]
Otros
LifeLab
Li
Tipos de ensayos
 DL50 oral en rata (15 cada 14 días por ensayo - dos ensayos a la
vez- n= 30)
 Irritabilidad dérmica en conejo: 3 cada 14 días/ensayo –2
ensayos- n=6 DL50 inhalatoria en ratas: 10 (5 ♀♀ y 5 ♂♂) por cada nivel de dosis
y aprox. son de 3 a 5 niveles. 50 ratas cada 14 días
 Absorción dérmica: 25 ratas cada 14 días por ensayo
 LC50 en Pez cebra. Efecto en organismos acuáticos. 35
(7/concentración).
 DL50 en aves (Coturnix coturnix).
Hepatotoxicidad provocada por
plantas medicinales
 Kava kava (Pipper methysticum).
 Se le atribuyen propiedades
ansiolíticas y contra el insomnio.
 En 2006, la FDA restringe su uso
debido a efectos hepatotóxicos.
¿ Se produce realmente dolor?
Aprox 2.7 million (2005,UK). 21.5% test toxicidad
Acute/subacute lethal studies (124.000 animals)
Acute/subacute range-finding, limit testing, etc(109.000)
Reproductive/teratogen/mutagen studies (71.400 )
Suiza (2001)
Nivel Dolor
N
Holanda (2000-01)
%
N
%
Bajo
343.385
69.8
419.576
56.6-52.0
Moderado
112.351
22.8
186.114
25.1-29.2
Severo
36.480
7.4
135.484
18.3-18.8
1. Leve:
Niveles de severidad Directiva 2011

Farmacocinético, única dosis y nº limitado de muestras de
sangre (totalizando < 10% del volumen circulante). No se prevé que la
sustancia cause ningún efecto nocivo perceptible;
 Administración de sustancias por vía subcutánea, intramuscular,
intraperitoneal, por sonda gástrica e intravenosa a través de los vasos
sanguíneos superficiales. Sustancia sólo tiene un efecto leve en el
animal, y los volúmenes se encuentran dentro de límites apropiados
para el tamaño del animal
 Estudios que implican la privación a corto plazo de interlocutores
sociales, enjaulado solitario a corto plazo de ratas o ratones adultos de
cepas gregarias;
2. Moderado:
Estudios de determinación de la gama de
dosis causante de toxicidad aguda,
subaguda y/o pruebas de toxicidad crónica/
carcinogenicidad, con EP no letales
3. Severo:
 Toxicidad, con situaciones fisiopatológicas intensas
y EP muerte. Ej, toxicidad aguda con una única
dosis (ver OCDE)
 Ensayo de potencia de una vacuna, caracterizada
por la (i) alteración persistente del estado del animal,
(ii) enfermedad progresiva que causa la muerte, (iii)
asociada con dolor, angustia o sufrimiento
moderados duraderos.
GUIDANCE
DOCUMENT ON THE RECOGNITION,
ASSESSMENT, AND USE OF CLINICAL
SIGNS AS HUMANE ENDPOINTS FOR
EXPERIMENTAL ANIMALS USED IN
OECD, 2000. Environmental Health and Safety
Publications. Series on Testing and Assessment
SAFETY EVALUATION
CLINICAL SIGNS AND CONDITIONS OF
ANIMALS REQUIRING
ACTION BY ANIMAL CARE STAFF AND
STUDY DIRECTORS.
MC
Toxicidad aguda
 Interacción de compuesto con las células y los
tejidos corporales y no sus efectos terciarios
(físicos)
 Estudio piloto previo a la investigación para
determinar los comportamientos indicadores de
dolor.
 Este estudio se hace < nº animales y dosis bajas
para poder fijar los end points.
 También se tendrá en cuenta la morbilidad en
lugar de la mortalidad
Toxicidad subcrónica ( 6 m) y crónica
(24 m)
MC
 Estudio sea efectivo la supervivencia > del 50%.
 Alojamiento para envejecidos (> 18 meses):
 Exceso de peso: lesiones en cojinete plantar, obesidad y tumores
 Jaulas piso sólido y un lecho adecuado.
 Agua y el alimento suministro especial.
MC
Enfermedades infecciosas, vacunas...
En animales infectados por bacterias Tª < de 34ºC implica
la muerte .
El end point se fija cuando:
Existe perdida de peso superior al 20%
La disminución de Tª animal es > 4ºC.
Los signos evidentes de dolor y sufrimiento son:
 Pelo erizado // Perdida de peso
Descarga ocular // Letargia
Encorvamiento // Ataxia
Hipotermia

Estudios de nutrición
Tipos de estudios
Relacionados con toxicidad de aditivos
alimentarios
Actuación y diseño de alimentos
funcionales
Alteraciones y disfunciones (anorexia,
obesidad)
Patologías del sistema digestivo
1. Leve:
 Alimentación con dietas modificadas, que no cubren
las necesidades nutricionales de todos los animales y se
prevé que causen una anomalía clínica leve en el periodo
de estudio;
 Confinamiento a corto plazo (< 24h) en j-metabólicas;
 Adición a la dieta de marcadores inertes para seguir el
paso de la ingesta
 Retirada de alimentación durante un periodo < a 24h en
ratas adultas;
. Moderado:
 Uso de jaulas metabólicas que impliquen una
restricción moderada de movimientos durante un
período prolongado (hasta 5 días);
 Estudios con dietas modificadas que no cubren las
necesidades nutricionales de todos los animales y que
se espera que causen una anomalía clínica moderada
en el periodo de estudio;
 Retirada de la alimentación durante 48 horas en ratas
adultas;
3. Severo:
 Uso de jaulas metabólicas que impliquen
restricción severa de los movimientos
durante un período prolongado;
 Inmovilización de ratas para inducir
úlceras gástricas o fallo cardiaco por estrés;
 Inflamaciones o ulceraciones
irreversibles en colon y digestivo
En Modelos inducidos o manipulados.
Ejemplo aplicados estudios de nutrición
1. Administración substancias biológicas activas:diabetes
con aloxano o de estreptotozina.
2. Por manipulación quirúrgica: ligadura pilórica;
hepatectomía parcial (regeneración hepática), etc
3. Por inducción basada en dietas modificadas: carenciales
o suplementadas base para el estudio de hiperlipemias,
esclerosis vasculares, hipovitaminosis, cancerogénesis.
Modelos dolorosos (colitis o inflamación intestinal)
 Mediante un enema de 10 mg de ácido
trinitrobencenosulfónico (TNBS) en 0,25 ml de
etanol al 50%
 Suplementación del agua de bebida con sulfato
de dextrano sódico (DSS) al 5% (p/v) en el agua
de bebida.
 Por transferencia de poblaciones linfocitarias por
vía intraperitoneal a ratones SCID.
Modelos inducidos
4. Inducción por cambios etológicos: modificaciones de
factores sociales o entorno, aslamiento, inmovilización.
5. Manipulación genética: transgénicos, obtención de > nº
modelos especiales y comprensión de acción de tipo
patológicos & terapéuticos
Ejemplos concretos
R obesa Zucker (fa/fa). Obesa a 5 sem.; edad,
pesando a las 40 sem. doble Rnormal. Por
hipertrofia-hiperplasia > tamaño, nº adipocitos.
r Non Obese Diabetes. Insulino dependiente.
infiltración del parenquima pancreático por linf.
CD8 y CD4, B y macrofagos.
Restricción de movimientos
Alimentación Controlada
 En períodos de tiempo fijados (uno o más /día) los
animales consumen tanta comida como quieran
 Para estudios con estado nutricional controlado.
 Sistemas automáticos de acceso al alimento
(chronofeeder)
 Permiten controlar la cantidad de comida
Reducción inmovilización
Envejecimiento/ Life span
Los vicios adquiridostransmitidos reciclaje y
actualización
 Reticencia aplicación de analgesia
Ej. Con colitis ulcerosa, la acción de probioticos no varia con
ketofen y buprenorphina
 Métodos invasivos anticuados
Ej. Vías de administración y extracción en desuso
 Inmovilización innecesaria
Ej retenedores vs telemetría y teledetección
 Aislamiento prolongado sin justificar
Ej. Animales aislado en alimentación restringida
 Métodos de eutanasia inapropiados
Ej. Inhalación éter vs sobreanestésico, CO2 vs C02+ O2
Elementos diana
formación. EXP & INV
Valorar nivel de BA(grupo/individuo)
Valorar nivel dolor/estrés/ansiedad y…
Aplicar mecanismos de reducción
Proporcionar una batería de cuidados
Limitar duración y severidad de
condiciones experimentales
 Reducción de riesgos (bioseguridad)





….. Gracias
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