ESPECTROMETRÍA DE MASAS
MOLECULAR.
Antecedentes de la espectrometría de masas
La espectrometría de masas es la de mayor aplicación, en el sentido de que
esta técnica es capaz de proporcionar información acerca:





Composición elemental de las muestras
Estructura de las molecular orgánicas, inorgánicas y biológicas.
Composición cualitativas como cuantitativas de mezclas complejas
Estructura y composición de superficies sólidas
Relaciones Isotópicas
Electrospray (nanoSpray) Ion Source in LTQ-FTICR mass spectrometer




La primera aplicación general de E.M en análisis químico
se produjo a principios de los 40´s, cuando esta técnica se
comenzó a usar para el análisis cuantitativo en mezclas de
hidrocarburos, antes este tipo de análisis se llevaba por
destilación fraccionada y posteriores medidas de ind. De
refracción. Para completar este tipo de análisis se llevaban
aprox. 200hrs o mas.
Sin embargo con el E.M. esta información se obtiene en
algunas horas o menos.
En los 80´s las aplicaciones del E.M experimento grandes
cambios en consecuencia del desarrollo de métodos de
producción de iones de moléculas no volátiles.
Actualmente esta técnica es aplicada en determinación de
estructuras de polipéptidos, proteínas y otros biopolímeros
de gran PM.
*Analito: etilbenceno
*Masa molecular:10^6 daltons
*Bombardea con haz de electrones para dar la formación de un
ión molecular como se muestra en la reacción:
C6H5CH2CH3 + e  C6H5CH2CH3(+) + 2e
El ión molecular es un ión radical y tiene el mismo PM que la
molécula.
La colisión entre los electrones y las moléculas del analito,
proporciona suficiente energía para dejarlas en estado
excitado, posteriormente se produce la relajación, con
frecuencia mediante la fragmentación de los iones
moleculares, que dan iones de masas bajas, por ejemplo en
el etilbenceno el producto mayor es: C6H5CH2(+) y aparte
CH3.
Los iones positivos producidos por el impacto de electrones
pasan a través de la rendija del E.M, de donde salen en
relación a su masa y su carga (m/z)
Al pico mas alto se le denomina pico base y se le asigna el
valor 100 de forma arbitraria, se considera la altura del
resto de los picos como porcentaje de la altura del pico
base.
Fuente de Iones

En la E.M. la formación de iones del analito en forma
gaseosa y la proyección y utilidad del mismo, esta
condicionada por el proceso de ionización.
Métodos separados en 2 categorías


Fase gaseosa: primero se volatiliza la muestra y luego
se ioniza. Esta está restringida a compuestos
térmicamente estables que tengan punto de ebullición
menores de 500ºC aprox., esto limita a compuestos de
pesos moleculares aproximadamente 10^3 daltons.
Fuentes de desorción: La muestra en estado liquido o
sólido se transforma directamente en iones gaseosos.
La ventaja de esta es que son aplicables a muestras no
volátiles y térmicamente inestables. Aplicable a
compuestos con PM de 10^5 daltons.
Las fuentes de iones se clasifican:


Fuentes duras: comunican la energía suficiente a
las moléculas de manera que se encuentran en un
estado de alta excitación, cuando se relajan se
producen iones fragmentados con una relación de
masa carga menor que el ión molecular. Nos
proporciona información de la naturaleza de los
grupos funcionales, así como información
estructural de los analitos.
Fuentes blandas: dan lugar a poca
fragmentación, así que el E.M. consta de un pico
y solo alguno o ningún otro pico. Nos permite la
determinación exacta del PM de la molécula o
moléculas
Diferencia en E.M de fuente dura y blanda
Fuente de Impacto de Electrones
E.M de impacto de electrones
Con objeto de formar un numero significativo de iones gaseosos en una
proporción reproducible, es necesario que los electrones generados por
el filamento sean acelerados mediante un potencial mayor de unos 50V,
esto logra hacer que se excite las moléculas, la subsecuente relajación
tiene lugar a una elevada fragmentación, que da iones de mas baja
masa que la del ión molecular, a estos se les llama iones hijos.
Los complejos E.M que se obtienen con ionización
por impacto de electrones son útiles para la
identificación de compuestos, por otra parte para
cierto tipo de moléculas la fragmentación es tan
efectiva que no queda ningún ión molecular, por
tanto la información para la determinación del
PM se pierde.
Picos de los Isótopos
En los EM a veces aparecen picos que
corresponden a masas mayores que la del ión
molecular, estos picos se atribuyen a iones que
tienen la misma formula química pero deferente
composición isotópica
Picos resultantes de las colisiones

Las colisiones ión-molécula:
pueden producir picos que corresponden a masas
mas elevadas que la del ión molecular, sin
embargo a presiones normales de la muestra, la
única reacción de este tipo que ocurre es la que
por medio de colisiones se transfiere un átomo de
hidrógeno al ión para dar un ión molecular
protonado, el resultado es un pico intenso, la
altura de este pico aumenta si aumentamos la
presión, así que la detección de esta reacción es
posible
Ventajas e Inconvenientes de las fuentes de
impacto de electrones
Ventajas:
Las fuentes de impacto de electrones son adecuadas para el uso
y producción de corrientes de iones elevadas, obteniéndose
buenas sensibilidades.
La extensa fragmentación y el elevado numero de picos nos
permite la identificación inequívoca de posibles analitos

Desventajas:
Puede dar la desaparición del ión molecular y esto nos impide
establecer el PM del analito.
Necesidad de volatilizar las muestras, por que se puede dar la
degradación térmica de las muestras


Ionización química.

Producida por el choque con iones de gas reactivo
bombardeado.

Casi siempre iones +.

2º más utilizado.

Modificaciones en zona de ionización.

Relación de concentración reactivo – muestra 103 a
104.

Reactivos.

Metano, (más común).

Sus colisiones generan.

Propano.

Isobutano.

Amoniáco.

Ventajas ionización química.

Impacto de electrones.

Ionización química.

Ionización por campo.

Campo eléctrico elevado (10^8 V/cm).

Emisores wolframio (agujas).

Efecto túnel (mecánica cuántica).

Poca fragmentación.

Espectro de ionización por campo.

Ionización por campo.
Impacto de electrones.

Fuentes de desorción.

Muestras:
No volátiles.
 Térmicamente inestables.


No requiere volatilización.

Espectro muy simple.

Desorción por campo.
Emisor con múltiples puntas.
 Sonda recubierta con muestra.
 Potencial elevado (puede haber degradación).


Desorcíon/ionización por láser asistida por una
matriz (MALDI).





Descrito en 1988.
Sustancia matriz absorbe radiación.
Láser pulsante sublima analito.
Espectro de tiempo de vuelo.
No hay fragmentación.

Sustancias matrices.

Ionización por electronebulización.

Descrita 1984.

Análisis biomoléculas.

Condiciones atmosféricas.

Otros métodos desorción.

Bombardeo con átomos rápidos.

Por plasma.

Iones secundarios.

Termonebulización.

Componentes del instrumento.
Sistemas de entrada de la muestra
Introducción de una muestra
representativa en la fuente de
iones.
Tipos de entrada:

Sistemas indirectos de entrada

Entrada por sonda directa

Entradas cromatográficas

Entrada de electroforesis capilar
Sistemas indirectos de entrada
Es el más simple
La muestra se volatiliza externamente entra a través de un diafragma de
metal o vidrio con varios orificios en la región de ionización (baja presión)
Muestras:
Punto de ebullición 500° C


Gaseosas: se recoge el gas entre dos válvulas en el área de medida que
después se expande en el contenedor
Líquidos: se introduce en un depósito una cantidad pequeña de la
muestra. (P: 10-5 a 10-4 torr)
Punto de ebullición 150° C se usa un horno y cintas calefactoras para
mantener la T elevada.
El sistema de entrada es de vidrio para evitar pérdidas de analitos polares
por adsorción.
Entrada por sonda directa





Para introducir líquidos o sólidos no
volátiles, se utiliza sonda que se inserta
a través de un cierre de vacío.
Cuando la cantidad de muestra es
limitada, se pierde menos muestra
Se coloca generalmente en la superficie
de un vidrio o tubo capilar de aluminio.
Esta a pocos mm de la fuente de
ionización, es posible obtención de
espectros de compuestos térmicamente
inestables.
La sonda permite el estudio de
materiales no volátiles
Sistemas de entrada cromatográficos y de
electroforesis capilar

Espectrómetro de masas acoplado
a CG, HPLC o columnas de
electroforesis capilar, que permiten
la separación y determinación
compuestos de mezclas.
Analizadores de masas
Separación de iones con diferente relación m/z


Sensible a diferencias muy pequeñas de masa
Permiten el paso un número de iones suficiente para producir corrientes
iónicas fáciles de medir
Resolución
Capacidad del instrumento de distinguir entre masas:
R = m / Δm
Donde Δm= diferencia de masa entre dos picos adyacentes resueltos
m= masa nominal del primer pico
Dos picos están separados si la altura del valle entre ellos no es mayor de
una determinada fracción de su altura (10%)
C2H4+
PM: 28,01313
CH2N+
PM: 28,0187
N3+
PM: 28,0061
CO+
PM: 27,9949
Resolución de varios miles
NH3+ PM: 17
CH4+ PM: 16
R < 50
Tipos de analizadores
Analizadores de sector magnético o espectrómetros de enfoque simple
Utilizan un imán permanente o electroimán
El haz procedente de la fuente de iones se desplaza (trayectoria circular 180, 90 o 60°.
Los iones son acelerado a través de la rendija B hacia el tubo analizador metálico (P
= 10-7 torr). Se puede hacer un barrido de los iones de diferente masa variando la
fuerza del campo del imán o el potencial de aceleración entre las rendijas A y B.
Estos iones pasan a través de la rendija de salida se recogen en un electrodo colector,
dando lugar a una corriente de iones. Se amplifica y se registra
R≤ 2,000
Los iones de la misma carga poseen la misma energía cinética, después de la
aceleración independientemente de su masa
Los iones que abandonan la rendija tienen la misma energía cinética . Los iones más
pesados se desplazan con velocidades menores.
Espetrómetros de doble enfoque
Combinación de campo magnético y electrostático
R = 10 5
Espectrómetro de masas cuadrupolar
Tiempos de barrido pequeños
Útil para realizar barridos de picos cromatográficos en tiempo real
Analizador de masas de tiempo de vuelo
Fácil acceso a la fuente de iones
Ilimitado intervalo de masas
Resolución y sensibilidad limitada
Analizadores de
trampa de iones
 Cationes o aniones
gaseosos pueden
confinarse largos
periodos de tiempo
 Campo magnético o
eléctrico
Instrumentos de transformada de Fourier (FT)




Mejor relación señal/ruido
Velocidades mayores
Sensibilidad y resolución elevadas
Aprovecha el fenómeno de resonancia iónica ciclotrónica
Espectrómetros de masas computarizados

Software interactivo y fácil de utilizar
APLICACIONES DE LA ESPECTROMETRÍA DE
MASAS MOLECULAR.

Las aplicaciones de la espectrometría de masas
son muy numerosas y abarcan demasiados
campos.

Identificación de compuestos puros.

El espectro de un compuesto puro proporciona
diversos tipos de datos que son útiles para su
identificación.
Peso molecular del compuesto.
 Fórmula molecular.


Además el estudio de los modelos de fragmentación
que se pone de manifiesto en el espectro de masas,
proporciona información sobre la presencia/ausencia
de diversos grupos funcionales.

La identidad de un compuesto se puede establecer
mediante la comparación de sus espectro de masas
con los de compuestos conocidos hasta llegar a total
coincidencia.

Determinación de los pesos moleculares a partir
de los espectros de las masas.

Por aquellos compuestos que pueden ionizarse por
alguno de los métodos anteriormente descritos, dando
un ion molecular o un ion molecular protonado o
desprotonado.

El espectrómetro de masas es una herramienta
insuperable para la determinación del peso
molecular, esta determinación requiere la
identificación del pico (M+1)+ o (M-1)+. La localización
del pico en la abscisa da el peso molecular una
precisión que no se puede alcanzar por ningún otro
método.

Una determinación por espectrometría de masas requiere
conocer con certeza la identidad del pico del ion molecular.

Es aconsejable ser precavido, en particular con las fuentes
de impacto de electrones, donde el pico del ion
molecular puede estar ausente o ser pequeño en relación
con los picos debidos a las impurezas.

Cuando existen dudas son particularmente útiles los
espectros adicionales de ionización química, de
ionización por campo y de ionización por desorción.

Formulas moleculares a partir de pesos moleculares
exactos.

Las fórmulas moleculares se pueden determinar a partir del
espectrómetro de masas de un compuesto, siempre que el
pico del ion molecular pueda ser determinado y su masa
exacta determinada; sin embargo, esta aplicación requiere
un instrumento de alta resolución.

Ejemplo.
Purina
Benzamidina
Etil Tolueno
Acetofenona
Fórmula
C5H8N4
C7H8N2
C9H12
C8H80
m
120,044
120,069
120,096
120,058
Si la masa medida del pico del ion molecular es 120.070 (±0,005),

Fórmulas moleculares a partir de relaciones
isotópicas.

Los datos de un instrumento de baja resolución que
sólo puede discriminar entre iones cuyas masas
difieren en un número entero de masa, pueden dar
información útil sobre la fórmula de un compuesto,
con tal que solo el pico del ion molecular, sea
suficientemente intenso para que su altura y las
alturas de los picos de los isótopos (M+1)+ y (M+2)+
puedan determinarse con precisión.

Ejemplo.
Un pico de ion molecular a una masa de 84 con
valores de (M+1)+ y (M+2)+ de 5,6*100 y 0.3*100
sugiere un compuesto que tenga la fórmula C5H80.

La relación isotópica es particularmente útil para
la detección y estimación del número de átomos
de azufre, cloro y bromo que hay en una molécula
debido a que contribuyen en gran medida a la
formación de (M+2)+.

Información estructural a partir de modelos de
fragmentación.

Los estudios sistemáticos de modelos de
fragmentación de sustancias puras han conducido al
establecimiento de ciertas guías que permiten
predecir los mecanismo de fragmentación y una serie
de reglas generales que son de utilidad para la
interpretación de espectros.
Característico de parafinas de cadena lineal.
 Normalmente los fragmentos de los hidrocarburos
más estables contienen tres o cuatro átomos de
carbono y los picos correspondientes son mas
grandes.
 Los alcoholes tienen un pico de ión molecular muy
débil o inexistente pero, a menudo, pierden agua
dando un pico intenso a (M-18)+.


Identificación de compuestos por comparación de
espectros.

Cuando hay compuestos de referencia disponibles, la
identificación final se basa en una comparación de los
espectros de masas del analito con los espectros de
muestras de referencia de los compuestos esperados.

No se puede suponer que los modelos de
fragmentación son únicos debido a los espectros de
estereoisómeros o de isómeros geométricos y
ocasionalmente tampoco es válida para ciertos tipos
de compuestos muy relacionados entre sí.

La ionización por impacto de electrones es el método
de elección para la comparación de espectros.

Sistemas computarizados de comparación de
espectros.

Los espectrómetros de masas más modernos están
equipados con sistemas computarizados de
comparación de espectros muy eficaces.

Se dispone de dos tipos de colecciones de espectros:


unas muy extensas (>15,000 espectros) disponibles se
comercializan por John Wiley & Sons; se encuentra
disponible en CD, con un software (PBM – STIRS) y,
otras más pequeñas pero muy específicas (pocos cientos y
algunos miles de espectros aplicables a un área
determinada, tal como residuos de pesticidas, drogas o
muestras forenses).

Análisis de mezclas por métodos espectrales de
masas acoplados.

La espectrometría de masas es insuficiente para el
análisis de mezclas, incluso de las más simples,
debido al gran número de fragmentos con diferentes
valores de m/z producidos en cada caso.

Se han desarrollado métodos en los que el
espectrómetro de masas está acoplado a un sistema
de separación eficaz. Esto se denomina “método
acoplado”.

Cromatografía/espectrometría de masas.

La GC/MS se ha convertido en una de las más
poderosas herramientas para el análisis de mezclas
orgánicas y bioquímicas complejas.

Electroforesis capilar/espectrometría de masas.

Este método acoplado se ha convertido en una
poderosa e importante herramienta para el análisis
de grandes hipopolímeros tales como:
Proteínas.
 Polipéptidos.
 Especies de DNA.


Espectrometría de masas en tándem.

Implica el acoplamiento de un espectrómetro de
masas a otro. En este montaje el primer
espectrómetro sirve para aislar los iones moleculares
de los diferentes componentes de una mezcla.

Estos iones se introducen uno detrás de otro en un
segundo espectrómetro de masas donde son
fragmentados para dar una serie de espectros de
masas, uno por cada uno de los iones moleculares
obtenidos en el primer espectrómetro.
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Espectrometría de masas molecular.