Extraído de las algas
Polisacárido lineal (con peso molecular ~12 000 Da)
Repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que
comprende unidades alternadas de galactosa y
3,6- anhidrogalactosa.
D-galactosa
3,6-anhidro-L-galactosa
% Agarosa
Tamaño de ADN
(pb)
0.75
10000-15000
1.0
500-10000
1.25
300-5000
1.5
200-4000
2.0
100-2500
2.5
50-1000
Buffer de corrida
Fosfatos que le
dan carga
negativa a la
molécula
Buffer de carga
xylene cyanol FF
1) Migra a aprox 4Kb;
Azul de bromofenol
1) Ayuda a visualizar que
la muestra este
migrando en el gel
2) migra a una velocidad
equivalente a si tuviera
un peso de 200 a 400
pb DNA (depende del
porcentaje de la
agarosa)
GLICEROL
Añade densidad a la
muestra
glicerol
Para cuantificar y visualizar el DNA se usan
agentes colorantes fluorescentes, los cuales
aumentan notablemente su emisión cuando
se unen a la doble hélice.
Son agentes intercalantes que se introducen
entre las bases del DNA. Generalmente son
policíclicos aromáticos, hidrofobos y
planares:
a) BROMURO DE ETIDIO
b) SYBR Safe DNA gel staining (invitrogen)


Estos agentes
interrumpen la
alineación y
emparejamiento de las
bases de las cadenas
complementarias.
La emisión de
fluorescencia se da
cuando se unen al DNA
de cadena doble y
depende directamente
de la cantidad de éste.
Bromuro de etidio
Generalmente se usa en
la detección de DNA de
doble cadena en PCR en
tiempo real.
Es estable a un amplio
rango de temperaturas.
Es 25 veces más
sensible que el bromuro
de etidio.
Es el más utilizado en
biología molecular
Teratogénico
Puede causar
metahemoglobinemia
Se trata de reactivos mutagénicos,
por lo que se deben trabajar con
equipo de seguridad.
El material contaminado con ellos
generalmente se trata con nitrito
sódico y ácido hipofosforoso para
su degradación.
También son usados en PCR,
citometría de flujo y separación de
ácidos nucleicos por ultracentrifugación.
Electroforesis en gel
Utiliza como soporte un
gel de poliacrilamida o
agarosa.
 Las moléculas se separan
de acuerdo con su tamaño
por su efecto de filtración
por geles, y también se
separan por su carga.
 Para teñir a las moléculas sujetas a
separación se usan a) colorantes, b)
autorradiografía o c) Western blot.

En el DNA, las diferencias de carga no
son suficientes para determinar una
separación eficaz. ESENCIALMENTE
CARGADO NEGATIVAMENTE
(FOSTATOS)
 Electroforesis en gel: la forma y la carga
son menos importantes, y la longitud
molecular es el determinante crítico de
la velocidad de migración. EN
PRESENCIA DE SDS

Gel de agarosa

Es más frecuentemente
usado para separar
ácidos nucleicos.
Gel de poliacrilamida-SDS

Es más frecuentemente
usado para separar
proteínas.
Cuando se separa DNA
Gel de agarosa
Gel de poliacrilamida-SDS
En ambos casos, el gel se prepara con distintas concentraciones en función del
tamaño de los fragmentos de DNA que se quieren separar.

Los fragmentos de DNA
que puede separar son
de hasta 20 kpb (más
grandes).

Se usan para separar
fragmentos de ADN más
pequeños
(aproximadamente hasta
1000 pb), ya que tienen
mayor poder de
resolución.
Cuando se separan proteínas
Gel de agarosa

Separa a la proteína
únicamente basado en
la carga molecular neta.

No separa proteínas con
diferentes tamaños pero
con cargas similares.
Gel de poliacrilamida-SDS

Separa proteínas basado
tanto en carga eléctrica
como en tamaño
molecular.

Separa proteínas con
diferentes tamaños pero
con cargas similares.

Mayor resolución que la
que se obtiene en un gel
de agarosa.
Gel de agarosa

Corren en forma
horizontal (submarina.)
Gel de poliacrilamida-SDS

Suelen emplearse en
forma vertical.
Gel de agarosa


En muestras de ADN
que se someten a un
campo eléctrico durante
cierto tiempo, podemos
verlas separadas según
su tamaño.
Se usan estándares de
peso molecular
Gel de poliacrilamida-SDS

Para estimar las masas
macromoleculares
comparando la muestra
con estándares.
Gel de agarosa
Aplicaciones:
 El análisis de fragmentos
de polimorfismos de
longitud de fragmentos de
restricción.
 Análisis de experimentos
de DNA recombinante.
 Purificación de sondas
para ISH.
 Hibridación por escisión de
fragmentos de DNA de un
gel seguidos por
purificación en minicolumna.
 Análisis del punto final de
PCR.
 Ensayos RT-PCR
(detección de patógenos).
Gel de poliacrilamida
Aplicaciones:
 El análisis de fragmentos
del punto final de PCR
en el cual el tamaño de
los fragmentos sea
ligeramente diferentes.
Sellar con cinta adhesiva el contorno de la bandeja de gel, colocar el
peine.
Pesar 0.42g de agarosa en un matraz Erlenmeyer, añadir 35 mL
de buffer TAE 1X. Tapar con algodón y calentar en microondas
hasta que la agarosa se disuelva bien o 1 a 3 min.
Una vez que la temperatura sea entre 45 y 60°C, añadir 2 μL de
bromuro de etidio.
Depositar el gel en la bandeja de la
cámara y dejar polimerizar.
Quitar la cinta adhesiva y colocar la
bandeja en la cámara de electroforesis.
Añadir el amortiguador TAE.
Preparación y cargado
de muestras
Etiquetar 4 tubos de microfuga E, P, R1 y R2
Reactivos
Estándar
(E)
Plásmido
sin digerir
(P)
Plásmido
digerido
con una
enzima
(R1)
Plásmido
digerido
con dos
enzimas
(R2)
-
-
-
Muestra
Amortiguador
de la muestra
Centrifugar por 3 seg
Cargado de
muestras
Colocar tapa
Aplicar 80 V
De 30-40 min
Detección de las bandas:
1. Colocar gel sobre un transiluminador, encender la
lámpara de UV
2. Visualizar bandas de DNA
3. Tomar fotografía
4. Determinar el peso molecular de las bandas
Std de peso molecular: Lambda
HindIII Ladder



λ HindIII DNA Ladder se
preparar por restricción del
fago seguido de la
inactivación de la enzima.
Los 7 fragmentos 564 base
pairs a 23.13 kilobases.
564, 2027, 2322, 4361,
6557, 9416, 23130 bp
Gel modelo
1
2
3
4
5
6
T
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Std de peso
molecular
Sin restringir
Sin muestra
Restringido
con 2 enzimas
Restringido
con 2 enzimas
e incubado
toda la noche
Restringido 1
enzima
VR
P
Inserto
RNA
T= topoisómeros; P= plásmido vacío (5310);
VR= vector+inserto (6500 pb), Inserto 1190
Bibliografía
Lizcano Losada F.; Fundamentos
moleculares en medicina. El manual
moderno, España, 2005. p 41-43.
 Mendoza DF. Practicas de Laboratorio de
Biologia Molecular: Su Aplicación en
Genetica Básica. Editorial de Universidad
del Rosario, Colombia, 2010. p 58-62
 Luque Cabrera J. Texto ilustrado de
biología molecular e ingeniería genética.
Elsevier, España, 2001. p 138.

Descargar

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA