• Macronutrientes, micronutrientes y factores
de crecimiento.
• Medios de cultivo. Técnica Aseptica.
Dra. Flor Teresa García Huamán
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Una característica de las células es su capacidad para llevar a cabo
reacciones químicas y organizar sus moléculas para formar
estructuras específicas. La expresión final de esta organización es
el crecimiento(reproducción).
Antes que una célula se divida, deben ocurrir muchas reacciones
químicas en la célula; estas reacciones se denominan
metabolismo.
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• Las reacciones metabólicas o bien liberan
energía o consumen energía.
Reacciones Catabólicas: Liberan energía.
Reacciones anabólicas: Consumen energía
• En la célula ocurren varios tipos de reacciones
anabólicas y catabólicas.
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Las células están compuestas fundamentalmente de
macromoléculas y agua, y que las macromoléculas se
componen de unidades más pequeñas denominados
monómeros.
La nutrición microbiana consiste en suministrar a las
células los ingredientes químicos que necesitan para
hacer monómeros.
Estos compuestos químicos son los nutrientes.
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Diferentes organismos necesitan diferentes tipos de
nutrientes y a menudo los requerimientos son específicos.
Además, no todos los nutrientes se requieren en las mismas
cantidades; algunos llamados, MACRONUTRIENTES, se
necesitan en grandes cantidades; mientras que otros llamados
MICRONUTRIENTES se requieren en menores cantidades, y a
veces sólo en cantidades trazas
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MACRONUTRIENTES
CARBONO Y NITROGENO:
Muchos procariontes necesitan algún tipo de compuesto
orgánico como fuente de carbono. Las bacterias pueden asimilar
varios compuestos orgánicos carbonatados y usarlos para hacer
nuevo material celular. Los aminoácidos, los ácidos grasos, los
ácidos orgánicos, los azúcares, las bases nitrogenadas, los
compuestos aromáticos y un sinfín de compuestos orgánicos de
otro tipo pueden ser usados por una u otra bacteria.
Algunos procariotas son autótrofos, capaces de construir todas
sus estructuras orgánicas a partir del dióxido de carbono (CO2)
con la energía obtenida de la luz o compuestos inorgánicos.
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En peso seco, una célula típica contiene un 50% de
carbono; el carbono es el principal elemento de todas
las clases de macromoléculas.
Después del carbono el siguiente elemento más
abundantes en la célula es el nitrógeno. En una bacteria
típica alrededor del 12% de su peso seco es nitrógeno,
este elemento es importante en las proteínas, en los
ácidos nucleicos y en otros constituyentes celulares.
En la naturaleza, el nitrógeno se presenta en forma
inorgánica y orgánica.
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Sin embargo, la mayor parte del nitrógeno natural disponible está
en forma inorgánica, como amoniaco(NH3), nitratos (NO3-) o N2.
La mayoría de las bacterias son capaces de usar amoniaco como
única fuente de nitrógeno, y otras muchas pueden usar nitratos.
El nitrógeno gaseoso N2 puede ser usado como fuente de
nitrógeno por algunas bacterias, las bacterias fijadoras de
nitrógeno.
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OTROS MACRONUTRIENTES: P, S, K, Mg, Ca, Na.
El fósforo se presenta en la naturaleza en forma de fosfatos
orgánicos e inorgánicos, y la célula lo necesita
fundamentalmente para la síntesis de ácidos nucleicos y
fosfolípidos.
El azufre se requiere por que es un componente estructural de
los aminoácidos cisteína y metionina y porque se presenta en
ciertas vitaminas, como la tiamina, la biotina y el ácido lipoico,
así como en la coenzima A.
El azufre sufre una serie de transformaciones químicas en la
naturaleza, muchas de las cuales son llevadas a cabo
exclusivamente por microorganismos y es utilizado por ellos en
varias formas químicas. La mayoría del azufre celular procede de
fuentes inorgánicas, ya sean sulfatos (SO4) o sulfuros (HS-).
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El POTASIO es necesario en todos los organismos. Una gran
diversidad de enzimas lo requieren específicamente como por
ejemplo algunas implicadas en la síntesis de proteínas.
El MAGNESIO funciona como estabilizador de los ribosomas, las
membranas celulares y los ácidos nucleicos, y también se
necesita
para
la
actividad
de
muchas
enzimas.
El CALCIO (que no es un nutriente esencial para el crecimiento
de muchos microorganismos) ayuda a estabilizar la pared celular
bacteriana y tiene una función importante en la termo
resistencia de las endosporas.
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El SODIO es requerido por algunos microorganismos, aunque no
todos, y su necesidad suele ser un reflejo del hábitat del
microorganismo. Por ejemplo, el agua de mar tiene un elevado
contenido de sodio y los microorganismos marinos normalmente
lo requieren para su crecimiento; en cambio, otras especies muy
relacionadas, pero de agua dulce, crecen bien en ausencia de
este elemento.
El HIERRO es fundamental en la respiración celular y es también
un elemento clave para los citocromos y para las proteínas que
contienen hierro y azufre implicadas en el transporte de
electrones.
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En condiciones anaeróbicas, el hierro se encuentra por lo general
en el estado de oxidación +2 y es soluble, sin embargo, bajo
condiciones aeróbicas suele estar en el estado de oxidación +3 y
forma varios minerales insolubles. Para obtener hierro de tales
minerales, las células las producen agentes quelantes de hierro
llamados sideróforos que solubilizan el hierro y lo transportan
dentro de la célula.
Un grupo importante de sideróforos derivan del ácido
hidroxámico y quelan el hierro férrico (Fe+3) fuertemente. Una
vez que el complejo hierro-hidroxamato pasa a la célula, el
hierro se libera y el hidroximato puede salir y ser reutilizado de
nuevo en el transporte del hierro.
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Las bacterias como Escherichia coli y Salmonella typhimurium,
producen sideróforos fenólicos, estructuralmente complejos
llamados enterobactinas. Estos sideróforos derivan del
compuesto aromático catecol y tienen una elevada afinidad de
unión de hierro. Sin tales agentes quelante de hierro muchas
bacterias serían incapaces de iniciar la infección debido a la
limitación del hierro.
En las agua marinas, el hierro es prácticamente indetectable (las
aguas oceánicas superficiales contienen típicamente sólo unos
cuanto picogramos de hierro por mililitro) y se han encontrado
bacterias marinas que producen sideróforos estructuralmente
complejos capaces de secuestrar el hierro en concentraciones
muy bajas.
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Estos sideróforos poseen una región peptídica unida al Fe+3 y una
región lipídica que se asocia con la membrana celular.
Compuestos como la aquachelina unen hierro, se agregan en
micelas y luego transportan el hierro a la célula.
Algunos procariotas pueden crecer en ausencia total de hierro.
Por ejemplo, las bacterias Lactobacillus plantarum y Borrelia
burgdorferii, no contienen hierro. El manganeso sustituye en
estas bacterias al hierro como componente metálico de las
enzimas que normalmente contienen Fe2+
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Mecanismos de captación de fierro
El hierro es un factor importante para el crecimiento de la
mayoría de las bacterias. El mejor mecanismo por medio del cual
las bacterias captan fierro son los sideróforos, los cuales son
compuestos de bajo peso molecular que quelan (atrapan) fierro
con alta afinidad. Existen tres tipos principales de sideróforos:
catecoles, hidroxamatos y un tercero que es una combinación de
ambos.
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Los sideróforos son producidos por la bacteria y excretados al
medio en el cual se unen al fierro y el complejo sideróforo-fierro
se une a receptores para sideróforo en la superficie bacteriana,
una vez que se ha internalizado el complejo sideróforo-fierro,
éste es roto para que libere el fierro en el interior de la bacteria.
Algunas bacterias no solo producen sus propios sideróforos sino
también producen receptores capaces de unir sideróforos
producidos por otras bacterias.
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MICRONUTRIENTES (Elementos traza)
Aunque los micronutrientes se requieren en muy pequeñas
cantidades son tan importantes para el funcionamiento celular
como los macronutrientes. Los micronutrientes son metales,
muchos de los cuales tienen una función estructural en varias
enzimas (los catalizadores de las células).
Debido a que la necesidad de estos elementos traza es muy
pequeña en cuanto a su concentración, con frecuencia no es
necesario añadirlos a los medios de cultivo para cultivar
microorganismos en el laboratorio.
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No obstante, si un medio de cultivo contiene compuestos muy
puros, disuelto en agua destilada de elevada pureza, puede
darse una deficiencia en algún elemento traza. En tales casos, se
añade al medio una pequeña cantidad de una solución de
metales traza a fin de suministrar los metales necesarios.
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FACTORES DE CRECIMIENTO
Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos que,
como los micronutrientes, se necesitan en muy pequeñas
cantidades y sólo por algunas células. Los factores de
crecimiento son vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas.
Aunque la mayoría de los microorganismos son capaces de
sintetizar estos compuestos, en algunos casos es necesario
suministrarlos en el medio de cultivo.
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Las vitaminas son los factores de crecimiento que se necesitan
con mayor frecuencia. Muchas vitaminas funcionan formando
parte de coenzimas. La mayor parte de los microorganismos son
capaces de sintetizar todos los componentes de sus coenzimas,
pero algunos no lo son y necesitan que se les suministren ciertas
partes de estas coenzimas en forma de vitaminas.
Las bacterias lácticas, tales como los géneros Streptococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc y otros, destacan por sus
requerimientos vitamínicos complejos, mucho más amplios que
los humanos. Las principales vitaminas requeridas por los
microorganismos son tiamina, biotina y piridoxina
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Los medios de cultivo son sustancias nutritivas que se usan
en el laboratorio para el cultivo de los microorganismos.
En microbiología, se usan dos tipos generales de medios de
cultivo:
Medios de cultivo químicamente definidos.
Medios de cultivo complejos.
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Los medios definidos se preparan añadiendo cantidades precisas
de compuestos orgánicos o inorgánicos purificados a un volumen
en agua destilada. Por tanto se sabe la composición química
exacta de un medio definido.
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Los medios complejos pueden ser entonces adecuados o incluso
ventajosos por varias razones. A menudo, los medios complejo se
emplean hidrolizados de caseína, carne, soya, levaduras u otras
sustancias muy nutritivas (pero sin embargo , no definidas
químicamente). Tales hidrolizados se están disponibles
comercialmente en forma de polvo y pueden ser pesados con
facilidad y disueltos en agua destilada para preparar un medio.
No obstante una limitación importante al usar un medio
complejo es que no se puede controlar su composición nutritiva
exacta.
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CULTIVO DE MICROORGANISMOS EN EL LABORATORIO
Una vez que ha sido preparado un medio de cultivo, puede ser
inoculado (es decir se le añaden microorganismos) y a
continuación incubados en condiciones que favorezcan el
crecimiento microbiano. En general, se tratará del crecimiento
de un cultivo axénico o puro, esto es, de un cultivo que contiene
sólo un único tipo de microorganismo.
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Para obtener y mantener un cultivo axénico o puro es esencial
evitar la entrada en él de otros microorganismos. Los
microorganismos no deseados llamados contaminantes, son muy
ubicuos, por lo que se han diseñado técnicas microbiológicas para
evitarlos.
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Un método importante para obtener cultivos axénicos o puros y
para asegurar la pureza de un cultivo es el uso de medios
sólidos en placas petri.
Los medios de cultivo se preparan con frecuencia en forma
semisólida o sólida mediante la adición al medio líquido de un
agente solidificante. Los medios sólidos inmovilizan a las células,
permitiéndoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas
colonias.
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Las colonias bacterianas pueden ser de forma y tamaño variable
dependiendo del organismo, las condiciones de cultivo, el
suministro de nutrientes (como la cantidad de oxígeno presente)
y otros parámetros fisiológicos.
Algunas bacterias producen pigmentos que dan color a las
colonias.
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Independientemente, de su posible pigmentación, las
colonias permiten reconocer la pureza del cultivo; las
placas que contengan más de un tipo de colonia no
fueron sembradas de un cultivo axénico o puro.
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Los medios sólidos se preparan igual que los líquidos
salvo que, antes de esterilizar los medios, se les añade
agar como agente gelificante, normalmente 1,5%. El
agar se funde durante el proceso de esterilización y el
medio fundido se vierte sobre las placas petri y se deja
que solidifique antes de usarse.
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Dado que los microorganismos son ubícuos , los medios
de cultivo deben ser esterilizados antes de usarse. Para
la mayoría de los medios de cultivo esto se realiza por
calor, habitualmente mediante calor húmedo en un
gran recipiente a presión llamado autoclave.
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Una vez preparado un medio de cultivo estéril, puede recibir un
inóculo de un cultivo puro y cultivarlo nuevamente. Esto
requiere el uso de la técnica aséptica.
La técnica aséptica consiste en una serie de procedimientos que
evitan la contaminación durante la manipulación de los cultivos y
los medios de cultivo estériles.
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El problema más común es la contaminación ambiental a través del aire; ya
que éste siempre contiene polvo en suspensión que generalmente lleva una
comunidad de microorganismos. Cuando las placas o tubos se abren deben
manejarse de tal modo que los contaminantes del aire no penetren.
La transferencia aséptica de un cultivo desde un tubo con medio a otro, se
realiza habitualmente con el asa bacteriológica previamente esterilizada a la
llama del mechero.
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Los cultivos en los que ha habido crecimiento se pueden
transferir luego a la superficie de placas con agar, donde se
desarrollarán colonias como resultado del crecimiento y división
de las células aisladas que han sido sembrados.
La siembra y resiembra por extensión de una colonia aislada es
un método idóneo para obtener cultivos axénicos o puros a
partir de mezclas complejas que contienen muchos organismos
diferentes.
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Analizar:
• ¿Qué significa la palabra estéril?.
• ¿Qué ocurriría si los medios de cultivo no se esterilizaran
después de su preparación?
• ¿Por qué es necesaria la técnica aséptica en la obtención de
cultivos axénicos o puros en el laboratorio?
Referencia bibliográfica:
Madigan, M.; J. Martinko; J. Parker. 2003. Biología de los Microorganismos. 10ma
edición. Editorial Pearson Educación, S.A. España.
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nutrición y cultivo de microorganismos