GRUPO DE PATÓLOGOS DEL NOROESTE
REUNIÓN ACADÉMICA 2013
BIOLOGÍA MOLECULAR BÁSICA PARA EL
PATÓLOGO
Luis Muñoz Fernández
Centenario Hospital Miguel Hidalgo
Biopath México
Aguascalientes, Ags.
López-Corella E. Patología 1991; 29: 65-66.
EL CONOCIMIENTO DEL CÁNCER A
LOS LARGO DEL TIEMPO
DeVita VT et al. Primer of the Molecular Biology of Cancer 2011: 4-5.
EL CONOCIMIENTO DEL CÁNCER A
LOS LARGO DEL TIEMPO
De Vita VT el al. Primer of the Molecular Biology of Cancer 2011: 4-5.
LiVolsi V, Upton MP. Am J Clin Pathol 2012;137: 341-342.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.
BIOMARCADORES
• Es una característica que se mide objetivamente
como un indicador de:
• Un proceso biológico normal.
• Una enfermedad.
• Las respuestas farmacológicas a una intervención
terapéutica.
• Tipos:
• Biomarcador pronóstico: evolución.
• Biomarcador predictivo: sensibilidad a cierto tratamiento.
• Biomarcador de monitorización: respuesta a un
tratamiento.
Jaffe CC. Arch Pathol Lab Med 2009; 133: 547-549.
BIOMARCADORES
• Biomarcadores pronósticos:
• La mayoría de los que detectamos en patología.
• Un buen ejemplo son los índices mitósicos o de
proliferación (PCNA, Ki 67).
• Biomarcadores predictivos:
• Her2-neu en cáncer de mama.
• Mutación de KRAS en cáncer de colon.
• Biomarcadores de monitorización:
• Fluorodesoxiglucosa en tomografía por emisión
de positrones (PET scan).
Jaffe CC. Arch Pathol Lab Med 2009; 133: 547-549.
BIOMARCADORES PRONÓSTICOS EN
NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS
Bahler D. Molecular Pathology of Hematolymphoid Diseases 2010: 66.
FIJADORES USADOS EN PATOLOGÍA
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008; 132: 251.
TÉCNICAS MOLECULARES EN TEJIDOS FIJADOS
EN FORMOL Y EMBEBIDOS EN PARAFINA
• Hibridación in situ fluorescente o
cromógenica (FISH, CISH).
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
• Secuenciación del ADN.
• Pruebas en ARN, como la PCR con
transcripción reversa (RT-PCR).
• Microarreglos para determinar la expresión
génica.
Dry, S et al. Am J Clin Pathol 2012; 137: 346-355.
DEGRADACIÓN DEL ADN EN TEJIDOS FIJADOS
EN FORMOL Y EMBEBIDOS EN PARAFINA
• Para los estudios moleculares, el tiempo de
fijación en formol debe ser entre 6 y 24 horas.
• El formol establece enlaces cruzados con el ADN,
las histonas y otras proteínas, fraccionando las
moléculas:
• Este proceso prosigue en los bloques tisulares a
lo largo de los años:
• Después de 10 a 20 años, la degradación puede
impedir la amplificación con PCR.
Dry, S et al. Am J Clin Pathol 2012; 137: 346-355.
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008; 132: 250.
PROTOCOLOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.
EXTRACCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Hunt JL , Sanja D. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 70.
FLUJO UNIDIRECCIONAL EN EL LABORATORIO DE PATOLOGÍA
MOLECULAR
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008, 132: 256.
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 67.
REACTIVOS DE LA PCR
• Polimerasa termoestable: Taq polimerasa u
otra:
• Pfu, Pwo, Tgo, Tli, Tth.
•
•
•
•
Cebadores (primers).
Desoxinucleótidos.
Solución amortiguadora (buffer).
Magnesio.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 77-78.
PCR
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008 132: 254.
PCR: CICLOS TÉRMICOS
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 75.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 74.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 75.
DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS DE
LA PCR (“AMPLICONES”)
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.
VARIEDADES DE PCR
•
•
•
•
Hot start: mayor especificidad.
Nested: mayor producción y especificidad.
Específica para metilación.
Multiplex: se amplifican varias regiones
simultáneamente.
• PCR con transcripción reversa (RT-PCR):
amplificación de secuencias de ARN.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 78-79.
PCR EN TIEMPO REAL
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 80.
PCR EN TIEMPO REAL
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 80.
MATRICES DE ADN (MICROARRAYS)
Quackenbush J. N Engl J Med 2006, 354: 2463-2472.
MATRICES DE ADN (MICROARRAYS)
http://www.columbia.edu/~bo8/undergraduate_research/projects/sahil_mehta_project/work.htm
APLICACIONES DE LAS MATRICES DE ADN
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 66.
Perou ChM et al. Nature 2000, 406: 747-752.
PERFILES DE EXPRESIÓN GENÉTICA EN CANCER DE MAMA
Lester SC. Pathologic Basis of Disease 2010.
ONCOTYPE PARA CÁNCER DE MAMA
http://www.oncotypedx.com/en-US/Breast.aspx
CÁNCER COLORRECTAL:
UNA ENFERMEDAD HETEROGÉNEA
• Diferentes vías moleculares de la carcinogénesis:
• Vía supresora convencional (60%):
• APC/β-catenina/Wnt.
• Vía de inestabilidad hereditaria de microsatélites (Lynch,
2 al 7%) :
• MSH2, MLH1, MSH6, PSM2.
• Vía de la mucosa aserrada (35%):
• Silenciamiento epigenético (metilación de islas CpG). TGFβ y BAX.
Shi Ch, Washington K. Am J Clin Pathol 2012, 137: 847-859.
Shi Ch, Washington K. Am J Clin Pathol 2012, 137: 847-859.
TRATAMIENTO DEL CARCINOMA DE PULMÓN
QUE NO ES DE CÉLULAS PEQUEÑAS (NSCLC)
• La neoplasia maligna que se diagnostica con
mayor frecuencia en el mundo.
• Más del 50% de los pacientes están en etapa
IV cuando se les hace el diagnóstico.
• En el 10 al 15% de los casos de carcinoma que
no es de células pequeñas (NSCLC) existen
mutaciones del EGFR: gefitinib, erlotinib.
• Rearreglos del gen ALK (gen de fusión EML4ALK) en el 5% de los NSCLC: crizotinib.
Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.
Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.
TRATAMIENTO DEL CARCINOMA DE PULMÓN
QUE NO ES DE CÉLULAS PEQUEÑAS (NSCLC)
• La mutación de KRAS es un predictor
negativo de las mutaciones de EGFR y de los
rearreglos de ALK.
• La amplificación de MET se asocia a la
resistencia al tratamiento con inhibidores de
EGFR.
Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.
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Biología Molecular Básica para el Patólogo