Capacidad de unión lipídica de la
Hemocianina en arañas
Integrantes:
Faura, Solange
Luna, Julia
Zúñiga, Emiliano
Hemocianina
 Pigmento respiratorio de invertebrados.
 Primer reporte de Hemocianina unida a lípidos por Zatta (‘81) en
Carcinus maenas, con supuesta función estabilizadora de la
estructura proteica.
En trabajos posteriores con Octopus tehuelchus se
sugirió la posible función de la hemocianina como
apolipoproteína.
Se encontraron tres lipoproteínas (VHDL, HDL y LDL)
que contenían Hemocianina.
 En Ampullaria canaliculata se encontraron abundantes
concentraciones de Hemocianina asociadas a pequeñas
cantidades de lípidos.
 En arácnidos se estudiaron tres especies: Eurypelma
californicum, Polybetes pythagoricus, Latrodectus mirabilis.
 Tomando como objeto de estudio P. pythagoricus se
procedió a aislar la lipoproteína, extraer los lípidos y
reconstituir la misma con distintos lípidos para medir la
capacidad de unión con cada uno de ellos.
Materiales y métodos
Aislamiento de la fracción lipoproteica de la hemolinfa
 Ultracentrifugación plasmática en gradientes de densidad.
 Se agregó un inhibidor de proteasas (TRASYLOL) con NaBr.
 Centrifugación 178.000 g durante 24 Hs.
 Separación en alicuotas de 0.3 ml.
 Monitoreo por espectrofotometría a 280 nm.
Deslipidación y reconstitución de la fracción
lipoproteica
• Se deslipida el VHDL con Triton-X-100, 0,02 gr/gr de
proteína.
• Se incuba a temperatura ambiente durante una hora, con
agitación.
• Se elimina el detergente.
• La fracción sin lípidos se extrae con solventes orgánicos.
• Se analiza por TLC-FID, para corroborar la ausencia total de
lípidos.
• Se reconstituyen las fracciones de lipoproteína con lípidos
marcados radioactivamente con C14.
Acido Palmítico
Fosfatidilcolina
Colesterol
Trioleina
Separación cromatográfica de la fracción marcada y
cuantificación de los lípidos unidos a la hemocianina
• Las muestras reconstituidas se analizaron con HPLC
(Cromatografía líquida de alta resolución) empleando
columnas de exclusión molecular.
• Las fracciones eluidas se analizaron en cuanto a su
contenido:
- Lipídico mediante radiactividad (medidas con un
Cocktail de Centelleo Líquido).
- Proteico mediante espectofotometría a 280nm.
Resultados:
El análisis de la espectrofotometría dio lugar a
un gráfico donde se pueden apreciar 3 picos en
los valores de absorbancia.
 Se observaron tres subfracciones de la hemocianina
correspondientes a: I) Heptámeros
II) Hexámeros
III) Monómeros
 Se separó la fracción de mayor absorbancia, que contiene
VHDL, la cual presenta la mayor concentración de
Hemocianina.
• Con el análisis de TLC-FID se confirmó que no se presentan
lípidos en la fracción proteica.
• Cuando se incrementan las
cantidades de lípidos incubados
con cantidades constantes de
hemocianina deslipidada,
se observan diferentes
proporciones de lípidos unidos a
la proteína, tendiendo a una
relación hiperbólica.
• La proporción molar máxima (Mr) entre
lípido/Hemocianina, se obtuvo en la fracción
de ácido grasos libes (ácido palmítico).
• La proporción molar mínima (Mr) entre
lípido /Hemocianina se obtuvo en la fracción
de Trioleina (Triacilgliceroles).
• Los valores más bajos de la constante de disociación (Kd) se
obtuvieron en la fosfatidilcolina y en el colesterol.
• Los valores más altos de efectividad máxima de unión
inicial lípido/proteína (Eo), se obtuvieron en el colesterol y
fosfatidilcolina.
• Los valores de Eo son inversamente proporcionales a los
valores de Kd.
• La proporción molar lípido/proteína in vitro en todos los
casos fue mayor que la encontrada bajo condiciones
fisiológicas.
• Hemocianina nativa tiene una
estructura dihexamérica. Esta puede
perderse por cambios en el PH,
concentraciones de cationes
divalentes y el NaBr
(Ultracentrifugación).
• De las tres subfracciones de Hemocianina, solamente la
hexamérica es similar a la estructura nativa y es capaz de
unir lípidos in vitro.
• En su estructura existen dominios de baja polaridad que
son capaces de interactuar con lípidos.
• Se presentan zonas hidrofóbicas que producen la gradual
saturación de los sitios de unión a lípidos, generando así la
relación hiperbólica antes mencionada.
• Bajo condiciones de saturación con colesterol y cantidades
variables de fosfatidilcolina, se llega a un reemplazo
equilibrado entre ésta y el colesterol.
Mediante este trabajo se
confirmó que la
hemocianina es la
apolipoproteína de unión
de lípidos de VHDL.
Posible trabajo posterior
Determinar el por qué de las variaciones entre PMR
y Mr/PMR.
Estudiar la posible variación de la unión de lípidos a
hemocianina bajo fluctuaciones en el nivel de
Oxígeno.
Cómo varía la proporción molar lípido/hemocianina
en diferentes condiciones estacionales y diferentes
estadios del desarrollo.
GRACIAS!!!!!
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