1
Objetivos:
Evidenciar un mecanismo de silenciamiento traduccional
que implica la liberación de una proteína integral ribosomal.
Proponiendo así, un modelo en el cual el ribosoma es visto
como un depósito de proteínas reguladoras, aparte de su rol
como maquinaria de síntesis proteica.
2
Introducción:
Ceruloplasmina (Cp): proteína de la fase aguda
sintetizada en el plasma por los hepatocitos y en zonas
de inflamación por medio de los macrófagos estimulados
por citoquinas.
Cada molécula contiene de 6 a 7 átomos de cobre, los
cuales le otorgan las funciones oxidativas a la proteína,
como por ejemplo facilitar la captación del hierro por
parte de la transferrina. Esto le da un importante rol en la
regulación de la homeostasis del plasma.
La función de la Cp derivada de macrófagos está menos
clara. Podría estar involucrada en actividad bactericida,
debida posiblemente al daño oxidativo causado por Cp.
3
Interferón gamma: induce el ARNm de Cp y su
expresión en monocitos de las células U937 (línea
celular humana) y en monocitos de la sangre periférica.
Cp está sujeta a un mecanismo de silenciamiento
traduccional.
Elemento GAIT: Inhibidor traduccional activado por
interferón γ en la región Cp 3´UTR (untraslated region)
del ARNm es necesario para el silenciamiento de la
traducción de Cp.
Proteína GAIT: Proteína de unión a GAIT, que bloquea el
inicio de la traducción.
4
Se identificó una proteína citosólica en las células U937
tratadas con interferón gamma que se une
específicamente al elemento GAIT: proteína L13.
En base a estos resultados se propone un mecanismo
de control traduccional en el cual el ARNm de Cp se
circulariza y permite la unión de la proteína GAIT
bloqueando la iniciación de la traducción.
Además se observó que el interferón gamma induce la
fosforilación de L13a, lo que causa su liberación desde
la subunidad grande ribosomal. Uniéndose luego al
elemento GAIT en la región Cp3´UTR y dando como
resultado el silenciamiento traduccional del ARNm de
Cp.
5
Resultados:
Identificación de la proteína ribosomal L13a
como un candidato a GAIT.
Método de triple híbrido en levadura:
Es una técnica de biología molecular que se usa para
detectar interacciones entre ARN y proteína. Muchos factores
de transcripción en eucariotas poseen al menos dos dominios
funcionales distintos, uno de ellos reconoce UAS (upstream
activation sequence) y otro promueve la maquinaria de
transcripción.
6
MS2
coat
protein
Presa
Híbrido de ARN
( ARNMS2 - ARNGAIT )
Los dominios son separados, el
dominio de activación (B42) se
recombina a la proteína de
unión al ARN de interés
(presa), mientras que el
dominio de unión al ADN
(LexA) se recombina a una
proteína de unión a ARN (MS2
coat protein).
También se fabrica un Cebo,
que es un hibrido de ARN, que
contendrá la secuencia GAIT (a
la que queremos unir la presa)
recombinada con ARN MS2 (al
que se unirá la proteína de
unión MS2).
7
La unión de un hibrido de ARN a cada una de las dos proteínas
quiméricas activa la transcripción de un gen reportero in vivo, en
este caso el His 3.
8
Las levaduras fueron cotransfectadas con los siguientes plasmidos:
Proteína quimérica: (presa)
ADNc
Dominio de
activacion
B42
La presa estaba contenida en una librería de
ADNc proveniente de celulas U937 monociticas
activadas con interferón γ en tendem con el
dominio de activacion B42.
ADNc- A partir de todo el pool ARNm
Híbrido de ARN: (cebo)
3`UTR- Cp
Como cebo se utiliza un hibrido de ARN
de la extension Cp 3` - UTR recombinado
con ARN de MS2.
MS2
9
Proteína quimérica:
La proteina MS2 coat protein corresponde
a una proteina de cubierta de virus que se
une al ARN. Lex A es la proteína de
reconocimeinto al ADN.
MS2 coat
protein
Lex A
Factor de transcripción
El Gen reportero HIS3 codifica la enzima
necesaria para la levadura auxótrofa de
histidina y le permite reproducirse en un
medio desprovisto de histidina.
Cepas AUXOTROFAS - Requieren Factores de Crecimiento ej: un
aminoácido
UAS (Upstream
activating
sequence)
His 3 (Gen
reportero)
10
Selección de Cepas recombinantes
106 clones de levadura
Medio deficiente
en Histidina.
103 clones tuvieron crecimiento
en este medio
5- fluoroorotic
acid (5- FOA)
Secuenciación
Se rastrearon 106 clones de levadura en un medio
deficiente en Histidina de los cuales en primer
lugar solo 103 fueron clones tuvieron crecimiento
en este medio, mostrando expresion del gen
reportero.
Para asegurar que la transcripción de His 3 es
dependiente de la presencia del elemento GAIT (Cp
3´- UTR) se hace una segunda selección con 5–
FOA, el cual causa el rechazo al plásmido que
contiene el cebo. Entonces los clones que dependan
de la presencia del cebo de ARN no podrán crecer en
un medio deficiente en Histidina con 5-FOA.
La secuenciación de estos clones identificó 15
sensibles a 5-FOA que contienen ORFs en Fase con
el dominio de activación de B42.
15 clones
11
15 clones
Medio que
contiene uracilo
Estos clones fueron replicados en un medio
rico en uracilo para sacar los plásmidos que
contienen el cebo y URA3, con el fin de
expresar la presa de unión a ARN en su
forma libre.
Expresión de la
presa en forma libre
12
Objetivo: Ensayar el silenciamiento
de
la
actividad
traduccional,
habilidad de lisados de inhibir
traducción.
cARN (Luc-Cp 3` UTR) sujeto a
traducción in vitro conteniendo 35S
metionina en presencia de extractos
citosólicos
de
los
clones
seleccionados.
Alícuotas de la reacción de
traducción fueron sujetas a SDS PAGE
y autoradiografía.
Como control se usa T7 gen 10
cRNA que no posee elemento GAIT.
Se observa una banda de menor intensidad correspondiente al clon ORF2, esto corresponde a
una menor cantidad de producto de traducción (Luc).
Concluyendo que solo el clon ORF2 inhibe la traducción del transcripto reportero quimérico
(Luc-Cp 3` UTR) pero no altera la traducción del transcripto control.
13
Objetivos: Mostrar interacción de ORF2 con Cp 3´-UTR.
Lisado del clon ORF2 sujeto a un EMSA usando como sonda Cp 3´UTR radio marcada.
Para los experimentos de competición los lisados fueron preencubados con un exceso
de elemento GAIT o con un mutante de Cp 3´UTR .
La presencia de banda en el carril 2 sugiere la
formación del complejo ARN- Proteína entre la
sonda y el ORF2.
La ausencia de banda en el carril 3 muestra que
la proteína ORF2 tiene especificidad de unión a
elementos GAIT. Se une a la sonda pero
también se une al elemento GAIT competidor,
por esto se visualiza una menor
intensidad de banda.
En el carril 4, se observa formación del
complejo, indicando que ORF2 tiene especificidad d
unión para la sonda y no para un
mutante de esta.
14
Objetivo: Verificar que los resultados obtenidos se deban al plásmido presente
en ORF2, y no a una alteración secundaria o a una mutación en el clon de la
levadura.
Recuperación del plásmido de ORF2 y retransformación en levaduras con el
cebo (bailt).
Las levaduras transfectadas con los vectores conteniendo ORF2 y Cp3’UTR (50-150)
crecieron en un medio sin histidina. Mientras que aquellas que carecian del cebo o
de la presa, no crecieron en un medio sin histidina (figura del medio).
Todas las levaduras transformantes crecieron en un medio con histidina (figura de la
derecha).
15
Secuenciación del ADN plasmídico de ORF2 (Fig. D): codifica para la proteína
ribosomal humana L13a, proteína integral de la subunidad ribosomal grande,
de 23 KDa con 202 aminoácidos.
Dos motivos consenso han sido descriptos en L13a (Fig. E): el “leucine zipper” y
el “dominio básico del leucine zipper”.
Parecería ser que L13a no tiene un rol directo en la formación de las
proteínas nacientes desde el ribosoma.
16
El L13a se une a Cp 3´-UTR en las células y
es requerido para el silenciamiento de la
actividad traduccional.
17
Se realiza un Ensayo EMSA supershif ARN para comprobar
que la proteína L13a se encuentra enlazada al elemento
GAIT.
Células U937 fueron tratadas con INF-γ
por 8 y 24 horas.
Extractos citosólicos resultantes del
tratamiento con INF- γ fueron incubados
con radio marcadores del elemento
GAIT.
Para confirmar la presencia de la
proteína L13a extractos tratados por
24hrs. fueron pre incubados con
anticuerpo anti-L13a polyclonal o con
suero pre inmune.
El ensayo EMSA demuestra que una proteína enlazada al elemento GAIT (marcado)
forma complejo ARN-Proteína sólo luego de 24hrs de tratamiento con INF-γ.
El “supershift” con el anticuerpo anti-L13a confirma que la proteína es la L13a.
18
Se testea la habilidad de la proteína L13a en la activación o
inhibición dela traducción de un transcripto reportero .
Se intentó comprobar si la actividad
traduccional del transcripto de ARN
reportero que contiene al elemento
GAIT, Luc-Cp 3’-UTR (50-150)-poly(A),es
silenciada o no por la proteína L13a.
Para ello, extractos citosólicos de
células U937 se trataron con INF- γ
por 8 y 24hrs.
Los extractos de 24hrs se sometieron
a una Inmunosupresión para remover
la proteína L13a con el anticuerpo antiL13a o suero pre inmune como
control.
Se adicionó también como control de
especificidad un transcripto de ARN
diferente, el T7 gen 10, que no tiene el
elemento GAIT.
19
Como resultado del ensayo de actividad traduccional in vitro podemos observar que:
En los primeros dos carriles con y sin
tratamiento de INF-γ durante 8 hrs hay
actividad traduccional.
•
En el primer carril de extractos tratados
por 24hrs con INF-γ no hay actividad,
sugiriendo que el L13a se unió al elemento
GAIT incluido en transcripto reportero
silenciando la actividad traduccional.
•
En el siguiente carril, con el agregado del
anticuerpo anti-L13a, se procedió a la
inmunosupresión sacando el L13a “del
camino” por lo que se detectó actividad
traduccional.
•
En el último carril con suero pre-inmune,
sin anticuerpo, no se observa marcado
sugiriendo el silenciado de la actividad
traduccional.
•
La remoción de L13a por inmuno-supresión demostró la habilidad de la
proteína para silenciar la actividad traduccional de las células U937 tratadas
por 24hrs con INF-γ.
20
Se investigó la interacción in vivo entre L13a y ARNm Cp en
células U937
Células U937 fueron tratadas con INF-γ por 8 y 24hrs, de los extractos citosólicos la
proteína L13a fue inmuno-precipitada (IP) con anticuerpo anti-L13a y el producto
obtenido fue amplificado por PCR-RT. El objetivo de este ensayo es demostrar la
existencia de un enlace intracelular de L13a con el Cp ARNm de éstas células.
Estos resultados demuestran que L13a es enlazada específicamente, y
en forma retrasada, al Cp 3’UTR de células U937 tratadas con INF-γ.
21
El L13a recombinante tiene actividad
silenciadora de la traducción.
22
La expresión de L13a recombinante(rL13a) en E.Coli y en
células de insectos fue testeada por análisis de
inmunoblot.
La rL13a fue testeada en células E.Coli y células de insectos infectadas con baculovirus y
parcialmente purificadas por cromatografía en gel filtración.
Como vector control (C) se usa ORF de L13a humano clonado en un vector pET-17b.
Ambos sistemas expresaron cantidades sustanciales de proteína recombinante pero las
proteína derivadas de células de insectos tuvieron una movilidad retardada levemente
comparadas con las células de E. Coli sugiriendo una posible modificación posttraduccional para las células de insectos.
23
La habilidad de rL13a es testeada también por traducción in
vitro en células U937, E. Coli y células de insectos.
Como control de
especificidad se utilizó el
gen T7 gen 10.
Como control positivo del
silenciado de actividad
traduccional se utilizaron
lisados citosólicos de
células U937 tratadas con
INF-γ por 24hrs.
En células E. Coli se detectó un marcado sustancial en ambos carriles (C y L13a) sugiriendo que
L13a de dichas células no afecta la traducción del transcripto reportero quimero Luc.
•En células de insectos se detecta banda en el vector C pero no en el vector con L13a sugiriendo
que L13a derivado de dichas células inhiben la traducción del transcripto reportero . De igual
manera sucede con en extractos de células U937 tratadas por 24hrs con INF-γ.
•La actividad silenciada de rL13a fue específica y no bloqueó la traducción sobre el transcripto
control T7 gen 10.
•
24
EL INF-γ causa la fosforilación retardada
del L13a en células U937
25
Método de Nothern Blot:
Es un método análogo al Southern
Blot, para estudiar la expresión de
genes por detección de uno o mas
ARNm específicos en una muestra total
de ARN.
El ARN es desnaturalizado,
separado por tamaño por electroforesis
y transferido a una membrana de nylon
donde es hibridizado y detectado con
una sonda marcada de ADN o ARN
complementaria.
26
Objetivo: examinar efecto del interferón γ
en la expresión de L13a

ARN fue separado de células U937
incubadas con interferón γ 0, 8 y 24hs.
 Sujeto a Nothern Blot usando ADNc
de L13a humana como sonda.
Conclusión:
El interferón γ no altera el nivel de ARN de L13a durante el período de tratamiento.
27
Método de Westernblot:
(Protein inmuno Blot)
Es una técnica analítica
usada
para
detectar
proteínas especificas en un
extracto.
Se
usa
una
electroforesis en gel para
separar las proteínas. Estas
son transferidas a una
membrana de nitrocelulosa
o
PVDF
donde
son
detectadas
usando
anticuerpos
específicos
para la proteína objetivo.
28
Objetivo: examinar la regulación posttranscripcional
 Extractos
de
células
U937
tratadas con interferón γ sujetos a
SDS-Page
 Realización de Inmunoblot con
anticuerpos anti-L13a
Conclusión:
El tratamiento con interferón γ no altera significativamente el nivel de expresión de
L13a. Sin embargo si modifica su movilidad, que es marcadamente disminuida luego del
tratamiento por 24 hs, sugiriendo una modificacion post – traduccional.
29
Immunoprecipitación (IP):
Es una técnica de precipitación de proteína usando un anticuerpo. Este proceso
puede ser usado para separar o concentrar una proteína particular de una muestra. La
inmunoprecipitación requiere que el anticuerpo se una a un sustrato solido en algún punto
del procedimiento.
El principio de la IP es muy simple, un anticuerpo mono o polyclonal contra un objetivo
especifico forma un complejo inmune con la proteína objetivo en una muestra como un
lisado. El complejo se une a un soporte solido donde una proteína A o G están
inmovilizadas y hacen al complejo insoluble que por tanto precipita.
30
Suero pre-inmune
Objetivo: examinar la posibilidad de que la
fosforilación de L13a cause el retardo en
la movilidad electroforética.
 Marcado metabólico con puso de 6hs de
32P-ortofostato
 Realización de Inmunoprecipitación con
anticuerpos anti-L13a
 Separación por SDS-PAGE
 Auto radiografía
Proteína L13a Fosforilada
Conclusión:
El L13a fue fosforilado en un curso de tiempo consistente con el retardo de la movilidad.
31
Objetivo: Determinar el rol de la
fosforilación, efecto del tratamiento con
fosfatasa en la actividad de L13a.
 Células U937 tratadas con interferón γ
fueron incubadas en fosfatasa alcalina.
 Realización
de
Inmunoblot
con
anticuerpos anti-L13a
Conclusión:
Muestra que la fosfatasa alcalina restaura la movilidad electroforética del L13a,
indicando que el retardo era debido a la fosforilación y mostrando también la efectividad
del tratamiento.
32
 Traducción in vitro del reportero Luc-Cp
3´UTR-polyA en lisados de reticulocito de
ratón tratados con interferón γ.
Conclusión:
El lisado con fosforilasa no inhibe la traducción in vitro del reportero
indicando el rol critico de la fosforilación de L13a en el silenciamiento de la
traducción.
33
Objetivo: Confirmar rol de L13a en la
actividad de silenciamiento traduccional
fue debido a fosforilación diferencial, se
usan proteínas recombinantes de L13a de
2 fuentes.
 Marcado metabólico con 32P-ortofostato
 Realización de Inmunoprecipitación con
anticuerpos anti-L13a
 Separación por SDS-PAGE
 Auto radiografía
Proteína L13a Fosforilada
Conclusión:
El L13 derivado de células de insectos fue fosforilado y era activo, mientras
que el L13 de E.coli estaba sin modificar y era inactivo.
34
 L13a recombinante construida por
células de insectos infectadas con
baculovirus son tratadas con fosfatasa
alcalina en presencia o ausencia de
inhibidor
L13 a es adicionado a la mezcla de
traducción
 Traducción in vitro del reportero LucCp 3´UTR-polyA en lisados de
reticulocito de ratón tratados con
interferón γ.
Conclusión:
El tratamiento con L13a derivado de células de insecto con fosfatasa alcalina bloquea la
actividad silenciadora.
35
Conclusión General:
Los resultados muestran que TODO el pool de L13a de las células U937 es
fosforilado luego de un tratamiento prolongado con interferón γ y esa
modificacion es requerida para el silenciamiento de la traducción.
36
El INF-γ induce la liberación del L13a de
la subunidad ribosomal 60S
37
Objetivo: Buscar cual es la forma en la que L13a se encuentra al enlazar al transcripto, ribosomal
(unida a la subunidad ribosomal 60S) o citosólica (no ribosomal)
AyB
Lisados de células U937 tratados con INF-γ fueron
fraccionados sobre un “cojín” de azúcar para separar la
fracción ribosomal del citosol libre de ribosomas.
-Ambas fracciones fueron sujetadas a SDS-PAGE y análisis
de inmunoblot con anticuerpos anti-L13a y anti-L28 para A y
B respectivamente.
-
Conclusión de A y B
L13a se enlaza al transcripto encontrándose en su
forma citosólica
C- De las fracciones ribosómicas y citosólicas se extrajo el
ARN y se visualizó con bromuro de Etidio sobre un gel de
agarosa-formaldehído.
Conclusión de C
La ausencia de ARN ribosomal 28S y 18S verifica
que en los procedimientos A y B se removieron
eficientemente todas las subunidades ribosómicas
intactas.
38
Discusión:
El INF-γ induce la liberación de L13a desde
la subunidad ribosomal
39
Entre las 2 y 4 hrs. luego del tratamiento con
interferón γ en células U937:
Cp ARNm es inducido y comienza su
traducción.
L13a esta en la subunidad ribosomal
60S en su forma no fosforilada.
Entre las 16 y 24 hrs:
L13a esta fosforilada y libre del
ribosoma. Esto se puede dar de dos
maneras posibles:
L13a se fosforila estando unida al
ribosoma, lo que causa su liberación.
L13a se disocia del ribosoma y
luego es fosforilada.
40
A las 24 hrs:
L13a libre y fosforilada se une al elemento GAIT Cp 3´UTR.
El silenciamiento requiere de la circularización del ARNm,
o más precisamente, de los elementos requeridos para la
terminación de la transcripción: cola de poly(A),
PABP (factor de iniciación de la traducción, proteína de unión a poly(A)), elF4G
(proteína de unión-cap).
Se propone que una función de la circularización sería yuxtaponer las
proteínas de unión a 3´UTR con el sitio de iniciación 5´donde se podría
ejercer control de la traducción.
41
4 posibilidades pueden ser consideradas para explicar el mecanismo por el cual GAIT
bloquea la iniciación de la traducción.
GAIT podría:
i.
Inhibir la función del complejo de
unión cap, elF4G
ii. Bloquear el reclutamiento del
complejo de preiniciación 43S
iii. Prevenir el rastreo del complejo
43S al codón de iniciación
iv. Bloquear la unión de la subunidad
ribosomal 60S
La función específica de la fosforilación de L13a no se conoce, pero podría
facilitar la unión al elemento GAIT , tanto directamente o por la unión de otras
proteínas en un complejo de unión al elemento GAIT.
42
El ribosoma como Depósito para Proteínas
de Control Traduccional
43
La liberación de varias proteínas ribosomales desde el ribosoma influye en la
traducción de proteínas específicas (o sobre un grupo de proteínas), sin alterar
la síntesis general del resto de proteínas.
L13a actúa de esa forma; las células U937 tratadas con INF-γ por 24 hrs. no
inhiben la síntesis global de proteínas.
Estudios con Cristalografía de rayos X de la subunidad ribosomal 50S de
Haloarcula marismortui (bacteria) muestran que la mayoría de la masa proteica
se encuentra como un dominio globular discreto sobre la superficie del núcleo
del ARN, lejos del sitio de catálisis.
44
Visualización por Cristalografía de rayos X de la subunidad ribosomal 50S con la proteína L13
de Haloarcula marismortui (bacteria), análoga a la proteína L13a de eucariotas.
Relación de L13 (proteína globular superficial de
la subunidad 50S) con otras proteínas
ribosomales y con el ARN.
El ARN está representado como hebras para revelar
las proteínas en el interior de la subunidad 50S. No
se ve ningún dominio de L13 sumergido, mostrando
que se encuentra enteramente en la superficie.
45
L13 tiene un mínimo contacto con los
dominios de la proteínas de superficie L3 y
L6.
La remoción de L13 del modelo expone
una depresión en la superficie del ARN
y muestra que L13 no interactúa con
ninguna proteína de las “enterradas”.
46
Se piensa que la unión de las proteínas al ARN depende de la topología
superficial del ARN y no de la especificidad en las secuencias de ARN.
L13 esta lejos de los sitios de elongación de cadenas y salida de polipéptidos,
esto apoya su no influencia en la síntesis de proteínas globales.
La estructura y posición de L13 disminuye las dificultades para su liberación
desde el ribosoma.
Se sabe poco acerca de la estructura y función de L13a en la subunidad 60S de
eucariotas. Análisis en Saccharomyces cerevisiae (levadura) del ribosoma 80S
sugiere que su proteína L16 ribosomal análoga a la L13a de vertebrados, está
localizada en la superficie del ribosoma.
47
Resumiendo…
Además de funcionar como maquinaría de la síntesis proteica, el
ribosoma actúa como un depósito para las proteínas de regulación
traduccional.
La función del retrazo en el silenciamiento de la traducción de Cp no es
conocida. Una posibilidad es sugerida por el hallazgo de que la actividad
bactericida de Cp es efectiva solamente en un escaso margen de
concentración. Alternativamente, la acumulación incontrolada de Cp en los
sitios de inflamación podría traer consecuencias perjudiciales relacionadas
con la habilidad del cobre de Cp para oxidar lipoproteínas.
El mecanismo de silenciamiento de la traducción podría haber
evolucionado para terminar o limitar la expresión de Cp por parte de los
macrófagos y de otras proteínas inflamatorias.
Varios mecanismos conocidos en la terminación de la inflamación,
implican el control traduccional.
48
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