Galectinas
Galectins: a key intersection between
Glycobiology and immunology
Línea de Investigación del
Dr. Gabriel Rabinovich
Galectinas:
- Son lectinas o moléculas con afinidad por los glúcidos
- Son una familia relacionadas por una misma afinidad
por afinidad por azúcares beta galactósidos, y secuencias
de aa compartida
Ázul: Dominio de unión a carbohidrato
¿Porqué el interés en las galectinas?
- Se caracterizan por ser moléculas muy conservadas
a lo largo de la evolución
- Están implicadas en varios procesos fisiopatológicos
vinculadas a adhesión celular, control de crecimiento
celular, embriogénesis, reproducción y en inmunomodulación
- Varían su expresión o se modulan por estímulos muy
variados: infecciones virales, agentes inflamatorios, tumores.
- Interaccionan tanto con glicoconjugados intracelulares
como extracelulares pero carecen de péptido señal
Antecedentes de Galectina-1:
La Galectina-1 recombinante evitó aparición de signos clínicos e
histopatológicos en una encefalomielitis experimental y en un modelo
de miastemia gravis autoinmune
1º OBJETIVO: demostrar el mecanismo por el cual GAL-1
es capaz de Inmunomodular.
HIPÓTESIS: galectina-1 disminuye el número de células T del bazo
Metodología:
. Purifica galectina 1 de pollo (CLL-1: chicken lactose lectin-I)
. Purifica células mononucleares de bazo (linfocitos) y las
estimulan con concanavalina A para que proliferen.
. Incuba las células T con la Galectina purificada
Tratamiento de linfocitos T con Gal-1 de pollo
Linfocitos T
de bazo
 Concanavalina A
10-3

10-2
Galectina-1 de pollo
Purificada
10-1
. GAL -1 indujo una marcada disminución de los linfocitos de un modo dosis dependiente
. Análisis de linfocitos apoptóticos (citrometría de flujo,
fragmentación de ADN y Microscopía electrónica)
Linfocitos controles
Linfocitos apoptóticos
Specific inhibition of lymphocyte proliferation and induction of apoptosis
by CLL-I, a beta-galactoside-binding lectin.
Rabinovich GA et al. .J Biochem. 1997;122:365-73.
2º OBJETIVO: encontrar la célula del sistema inmune
que secrete GAL-1 e induzca apoptosis de linfocitos T
Hipótesis: El macrófago expresa Gal-1 y lo incremente (upregula,
sobreexpresa) frente a diferentes estímulos inflamatorios.
Metodología:
. Purificar macrófagos del peritoneo de rata
. Exponer a los macrófagos a diversos estímulos
(Ej: antígenos bacterianos)
. Analizar la expresión de GAL-1 por inmunocitoquímica
(inmunofluorescencia) y por Western Blot.
WESTERN BLOT
Significativo incremento
de Gal-1 en macrófagos
activados
PMA: éster de forbol phorbol ester
FMLP: formylmethionine oligopéptico
(péptido quimiatractivo)
PP: proteasa
LPS: lipopolisacárido de Gram neg.
BCG: bacilo de la tuberculosis
R: macrófagos residentes
Western Blot
Gal-1
INMUNOFLUORESCENCIA DE GAL-1
Estímulo
inflamatorio
activador
Gránulos
de Gal-1
Macrófagos
peritoneales
CONCLUSIONES
- GAL-1 se licaliza en macrófagos
- Marcado incremento de Gal-1 por estímulos
inflamatorios y activadores
- Además de aumentar cambia la localización
Regulated expression of a 16-kd galectin-like protein in activated rat
macrophages. Rabinovich G, Castagna L, Landa C, Riera CM, Sotomayor C.
J Leukoc Biol. 1996 Mar;59(3):363-70
3º OBJETIVO: vincular a los macrófagos con la inmunoregulación de linfocitos mediante la inducción de apoptosis
Hipótesis: la GAL-1 purificada de macrófagos induce la muerte
por apoptosis de los linfocitos.
Metodología:
. Purificación y activación de macrófagos de peritoneo de rata.
. Purificación la GAL-1 producida por macrófagos activados
para secuenciarla e identificarla como galectina.
. Incubar los linfocitos purificados de bazo con Gal-1 de
macrófagos
. Analizar apoptosis en la población de linfocitos
Galectina-1
Estímulo
activador
Identificación de Galectina-1 purificada
de macrófagos de rata por Western Blot
Análisis de la secuencia de aa
1- CLL-1 purificada (pollo), 2-RMGal (macrófago de rata), 3- Control negativo
Gal-1 de macrófagos induce apoptosis de Li T
RMGal-1
Li T
Li T apoptótico
Microscopía
Electrónica
Mecanismos inmunomodulador clave de Gal-1
RESULTADOS
Fragmentación de ADN para identificar
APOPTOSIS
Análisis electroforético de la fragmentación
de DNA inducida por RMGal
Calle 1: células mononucleares de bazo
Calle 2: células de bazo+ Concanavalina A
Calle 3: células de bazo+ Con A + RMGal-1
Activated rat macrophages produce a galectin-1-like protein that induces apoptosis
of T cells: biochemical and functional characterization. Rabinovich GA et al
J Immunol. 1998 May 15;160(10):4831-40.
4º OBJETIVO: evaluar los efectos terapéuticos de galectina -1
en la artritis reumatoidea
Hipótesis: Gal-1 mejora la artritis reumatoidea induciendo
apoptosis de Linfocitos T autoinmunes.
Metodología:
. Poner en marcha un modelo de artritis inducida con colágeno en ratones
genéticamente susceptibles (DBA/1 mice).
Modelos de tratamientos
1. Fibroblastos transfectados con mGAL-1 son inyectados en ratones
artríticos en el día que comienzan los síntomas.
2. Galectina-1 recombinante inyectada en el modelo en el mismo día.
. Seguimiento de la artritis por evaluación clínica-histopatológica y
determinación de anticuerpos anti-colágeno (Bioensayo)
Evaluación
Clínica-Histopatológica
del efecto terapéutico de Gal-1
1-Evaluación de paw swelling
(a and d) expresado en mm
(mean ± SEM).
2- Score clínico (b and e)
3- Número de arthritic paws
(mean ± SEM) (c and f).
Inyección única de
fibroblastos que
expresan Gal-1
Administración
diaria de Gal-1
Determinación histopatológica del Joints
Histological Score (de la articulación).
Los ratones tratados con fibroblastos transfectados
con mGAL-1 tienen articulaciones normales en su
mayoría, y algunos moderados.
Los ratones controles mostraron en su mayoría
artritis moderada y severa.
RESULTADOS
Susceptibilidad incrementada de las células linfáticas a morir
por apoptosis después de la terapia génica con GAL-1
Análisis de apoptosis por contenido de DNA Hipodiploide y
por fragmentación de ADN
Recombinant galectin-1 and its genetic delivery suppress collagen-induced arthritis
via T cell apoptosis. Rabinovich GA, Daly G, Dreja H, Tailor H, Riera CM,
Hirabayashi J, Chernajovsky Y. J Exp Med. 1999;190(3):385-98.
En macrófagos
GALECTINA- 1
En células tumorales
Apoptosis de Li T
Apoptosis de Li T
DISMINUYE
AUMENTA
AUTOINMUNIDAD
MECANISMOS
DE ESCAPE
TUMOR
5º OBJETIVO: demostrar si galectina -1 es utilizada por las
células tumorales como un mecanismo de escape de las células T
Antecedente:
.
. La mayoría de tumores desarrollan
estrategias para esquivar el
ataque tumoral.
. Las células de melanoma tienen un alto contenido de galectina-1
Hipótesis: La galectina-1 de melanoma le confiere un inmunoprivilegio a las células tumorales favoreciendo su sobrevida
escapando del sistema inmune
Metodología:
. Evaluar la presencia de galectina-1 en células de melanoma humano.
. Transfectar las células de melanoma con cDNAantisentido para Gal-1
. Desafiar los ratones transfectados, inyectándolos con una masa tumoral
Análisis de galectina -1 enmelanoma humano
WB de homogenatos de líneas
celulares
Inmunofluorescencia de la línea
celular B16
Efecto de la transfección de células de melanoma
con cDNAantisentido para Gal-1
Expresión de Gal-1
Apoptosis inducida
A: Intensa secreción de Gal-1 por melanoma murino (B16(/-) en comparación
con los distintos knockdown
C: Análisis de apoptosis de células T con anti-anexina
EVALUACIÓN DE CAMBIOS EN LA MASA TUMORAL
La inhibición de la expresión de Gal-1 vuelve al ratón más resistentes
a los desafíos con el tumor
. Usando transfectado (knocked down) se demostró que la
presencia de Gal-1 en los tumores contribuye al escape tumoral
. Bloqueando los efectos de Gal-1 en el tumor, se logró
reducir la masa tumoral
. Estos resultados le permitieron demostrar que los tumores
evaden a los linfocitos T efectores a través de mecanismos
dependientes de Gal-1.
Targeted inhibition of galectin-1 gene expression in tumor cells results in heightened
T cell-mediated rejection; A potential mechanism of tumor-immune privilege.
Rubinstein N…….Rabinovich GA. Cancer Cell. 2004;5(3):241-51
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