Resistiendo el estrés oxidativo:
La travesía de Trypanosoma cruzi
a la infección
Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi
Tomado de “The Trypanosoma cruzi Proteome” Atwood III et al;
Science Vol 309; 2005
Respuesta inmune innata
1-
Respuesta celular
Activación de macrófagos residentes,
células de Langerhans y NK
Producción de interleuquinas proinflamatorias
2-
Sistema del complemento
Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno
Rol central de los macrófagos en el control de la infección
Fagocitosis como primera línea de defensa
contra la infección por T. cruzi
Interacciones Macrófagos - T cruzi
2 O2 + NADPH  2 O2
•–
+ NADP+ + H+
Rápida activación de la NADPH oxidasa durante la fagocitosis
8
min
Villalta et al, 1984
Alvarez, MN et al, 2007
Óxido Nítrico Sintasa
Actvadores:
IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6,
productos derivados de patógenos
(virales, bacterianos y de protozoarios)
Inhibidores:
IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β
Interacción con células apoptóticas
Especies Reactivas
del Nitrógeno
Especies Reactivas
del Oxígeno
RNH2
O2
+ 1e-
NADPH
oxidasa
i NOS
Superóxido O ● _
2
(anion radical)
+ 1e-
Peróxido
de
Hidrógeno
●
SOD
-
ONOO
H2O2
NO2¯
Óxido
Nítrico
●
NO2
+ 1e-
Nitrito
- 1e- Peroxidasa/H2O2
(MPO)
ONOOCO2¯
Radical
OH¯+ OH●
Hidroxilo
Dióxido de
Nitrógeno
- 1e●
2 H2O
NO
peroxinitrito
+ 1e-
ONOOH
- 5e-
- 1e-
CO2
H+
L-Arginina
NO2 + OH●
●
NO2 + CO3●¯
NO3¯
Nitrato
Oxidantes intrafagosomales
Macrófago no estimulado
2 hrs de infección
Oxidantes intrafagosomales
Macrófago estimulado con IFN-ϒ
2 hrs de infección
Citotoxicidad de macrófagos contra Tripomastigotas
rol del ONOO- en el control parasitario
Amastigotas intracelulares
Infección (%)
100
80
60
*
40
20
0
●-
O2
● ●
O2 +
NO
Apocinina
Defensas Antioxidantes en T. cruzi
Las peroxiredoxinas de Trypanosoma cruzi tienen actividad
peroxinitrito-oxidoreductasa in vitro
NADPH
TRox
(10 3 M-1s-1)
(10 3 M-1s-1)
T(SH)2
TXNox
TcCPXRed
ONOOH
10 6 M-1s-1
NADP +
TRred
TS2
TXNred
TcCPXOx
NO2-
TR = tripanotiona reductasa
T(SH)2= tripanotiona
TXN = triparedoxina
TcCPX= triparedoxina peroxidasa citosólica
Trujillo et al, 2004
Resistencia de TcCPX a la citotoxicidad
mediada por ONOO-
Células Control
Células Control + ONOO-
TcCPX + ONOO-
Resistencia de cepa TcCPX
In vitro
In vivo
salvaje
Tc CPX
Tripomastigotas en 50 campos
Infección (%)
120
100
80
60
*
40
20
0
O2●
-
ONOO-
O2●
-
Infección en macrófagos
ONOODías post-infección
Infección en ratones
Evaluación in vivo
Caracterización de las cepas
TCC
CL-WT
Contenido de Enzimas Antioxidantes
Contenido relativo de enzima
Anticuerpos específicos
TcCPX
TcMPX
TcTS
Epimastigotas de 3 días
Tripomastigotas Metacíclicos
TcCPX
TcMPX
TcTS
Contenido relativo de enzima
(tripomastigota metacíclico)
Enzimas antioxidantes: factores de virulencia
Tripomastigotas en 100 campos
Tripomastigotas en 100 campos
Respuesta inmune innata
1-
Respuesta celular
Activación de macrófagos residentes,
células de Langerhans y NK
Producción de interleuquinas proinflamatorias
2-
Sistema del complemento
Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno
Muerte Celular Programada en T. cruzi
Estímulo de muerte: suero humano fresco (SHF)
Control
SHF
CTL SHI SHF
Ctl
SHF
Tinción de núcleos apoptóticos
Fragmentación ADN
Exposición de fosfatidil-serina
Activación del complemento
sobre la superficie del parásito,
Influjo de Ca2+ y disfunción
mitocondrial
Irigoín, F et al., 2009
O2- como mediador de la MCP
Mito-Hidroetidio
HE
Detección de O2- mitocondrial en T. cruzi
(Mitosox)
Smith and Murphy, 2003
Dimetoxi naftoquinona (DMNQ)
O2- mitocondrial como mediador de la MCP
MitoSOX oxidado
Tinción nuclear
Exposición a suero humano fresco
Protección de la MCP por Fe-SOD
Sobreexpresión de la Fe-SODA
Control
TcSODA
bp SHI SHF SHF SHI
2 O2
•–
+
2H+
k = 109 M-1 s-1
O2 + H2O2
Parásitos apoptóticos en el huesped vertebrado
Infección in vitro
Cardiomiocitos
Infección in vivo
Corazón(14 dpi)
Macrófagos peritoneales
Souza EM et al., 2003 Cell and Tissue Research.
Activación Clásica
Peluffo et al., 2004
Trends in Parasitol. 20(8)-363
Activación Clásica
Activación Alterna
Peluffo et al., 2004
Trends in Parasitol. 20(8)-363
Determinantes de la eficiencia de la infección
por Trypanosoma cruzi
Establecimiento temprano de una respuesta proinflamatoria con
inducción de la iNOS en macrófagos
Niveles de enzimas antioxidantes en los tripomastigotas metacíclicos
Presencia de parásitos apoptóticos en el inóculo infectivo
PERSPECTIVAS
Búsqueda de inhibidores específicos que interfieran
con la red antioxidante de Trypanosoma cruzi en vistas
a un tratamiento coadyuvante
Evaluación de la MCP en nidos de amastigotas
dilucidando las señales que llevan a la inducción
del proceso de muerte
Departamento de Bioquímica
María Noel Alvarez
Gonzalo Peluffo
Florencia Irigoín
Madia Trujillo
Carlos Robello
Rafael Radi
Colaboración Internacional
Shane Wilkinson
Martin Taylor
John Kelly
Paola Zago
Miguel Basombrio
Howard Hughes Medical Institute
PEDECIBA (Uruguay)
CONICYT (Uruguay)
PDT (Uruguay)
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