Presentado por: Azzam Sofía, Gentilini Lucas, Krawzcyk María y Reinert Marina.
RNA polimerasas
• En eucariotas hay tres clases de RNA polimerasas, según el tipo de RNA que se
va a transcribir:
- RNA polimerasa I: Cataliza la síntesis del pre-rRNA (45S), en el nucléolo.
- RNA polimerasa II: Responsable de la síntesis del precursor de los mRNA.
-RNA polimerasa III: Produce los tRNA y el rRNA 5S.
• Sensibilidad a α- amanitina (procede del hongo Amanita phalloides) de las
distintas RNA polimerasas:
I.- Sensibilidad muy baja.
II.- Muy sensible
III.- Sensibilidad intermedia
• RNA pol II esta formada por numerosas subunidades, la subunidad grande
presenta numerosas repeticiones en su extremo carboxilo-terminal: secuencia
CTD.
Dominio carboxilo terminal (CTD)de RNA pol II
• Consiste en una serie de hasta 52 repeticiones de la secuencia TyrSer-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser (heptena).
• Está involucrado en todas las etapas de la transcripción y su estado de
fosforilación determina que se lleven a cabo eficientemente.
• Para que se inicie la transcripción el CTD no debe estar fosforilado,
mientras que para que avance la ARN polimerasa II y deje el promotor,
hace falta que el CTD esté fosforilado.
• Los factores encargados del procesamiento del pre-ARNm se unen al
CTD para realizar su función: el agregado del CAP en el extremo 3´, la
poliadenilación en el 5´ y el “splicing” de exones.
• Se ha comprobado que determinadas repeticiones del heptapéptido
del CTD son necesarias para el normal crecimiento y viabilidad de las
células.
SPLICING!
Mecanismo post transcripcional de corte y empalme del ARN
El Splicing alternativo permite obtener a partir de un pre-ARNm distintas moléculas de ARNm
maduras. Este proceso ocurre principalmente en eucariotas, aunque también puede
observarse en virus.
Algunos datos interesantes….
El splicing es frecuentemente cotranscripcional y funcionalmente acoplado a la
transcripción. Sin embargo puede ocurrir independientemente in vitro, pero es menos
eficiente que in vivo o que en sistemas in vitro pero acoplados a la transcripción.
Ambos procesos comparten muchos componentes de sus maquinarias proteicas.
Si bien Amoeba dubia(unicelular) tiene el genoma más grande del mundo 670.000 Mb,
siendo 230 veces más grande que el humano (2900 Mb), el 60% de los genes humanos
son suceptibles al splicing alternativo, lo que aumenta increíblemente el potencial
codificante del genoma.
De todas maneras, parece haber un alto grado de coordinación entre eventos de
splicing vecinos, que pueden limitar el numero de variantes de los genes, la
transcripción jugaría un papel principal en dicha coordinación.
Dos modelos se han propuesto para explicar el fenómeno de acoplamiento splicingtranscripción.
El modelo cinético: “First come, first serve”
• Considerando la longitud media de los intrones, el
periodo entre la transcripción de un exón y el
siguiente es lo suficientemente larga para que el
spliceosoma se una al primer exón antes de que el
siguiente se presente. Esto permitiría que un exón
“débil” no tenga que competir con uno “fuerte”.
• Esto deriva en que una tasa de transcripción lenta
favorece la inclusión de exones débiles mientras que
una tasa elevada favorece su exclusión.
Modelo cinético
El modelo de
reclutamiento:
• La unión al promotor de
activadores o co-activadores
de la trascripción influencia
diferencialmente
el
reclutamiento de factores de
splicing.
Proteínas SR y SRp20
• Las proteínas SR son factores esenciales y moduladores de splicing
constitutivo y alternativo respectivamente; constituidas por 1 ó 2 dominios de
unión a RNA, (amino terminal) y un dominio rico en dipéptidos repetidos de
argininas y serinas, RS (carboxilo terminal).
• Son reguladas por fosforilación.
• Reconocen secuenacias potenciadoras exonicas (ESEs).
• El dominio RS se une al punto de ramificación de un pre- mRNA participando
de manera importante en el splicing.
• Trabajos anteriores demostraron que SRp20 esta involucrada en el splicing
alternativo de varios transcriptos, dado que su nivel de expresión influencia la
selección del sitio de splicing. ( Regulated expression and RNA processing of
transcripts from the Srp20 splicing factor gene during the cell cycle. H Jumaa, JL
Guenet and PJ Nielsen. Max Planck Institute for Immunobiology, Freiburg im Breisgau,
Germany).
Resultados
La cola de CTD tiene algún efecto sobre el
splicing alternativo?
0 hs
transfección
24 hs
α- amanitina
48 hs
harvest
Hepatoma 3B
tranfección
RT-PCR
VECTOR
(WTres / ∆CTD)
MINIGEN EDI
(≠ promotores + EDI)
RNA pol II + α-amanitinaRes
RT-PCR
La cola de CTD tiene algún efecto sobre el
splicing alternativo?
RNAm
Control negativo
∆CTD aumenta la inclusión de EDI independientemente del promotor utilizado
•
Usan promotores constitutivos que estarán activos antes y después del
tratamiento con α-amanitina.
RNAm trancripto tanto por RNA pol II endógena como exógena (WTRes / ∆CTD) antes
del tratamiento.
•
∆CTD pol II tiene capacidad limitada para transcribir plásmidos
transfectados.
SISTEMA INDUCIBLE
• Para ver si el efecto en el splicing alternativo visto
depende del transcripto dado por ∆CTD pol II.
• Controlo a nivel temporal la transcripción del
minigen EDI.
SISTEMA INDUCIBLE: Tet-Off
Se basa en la activación del gen de interés por parte de la proteina de
transactivación por tetraciclina (tTA).
Cuando tTa se une al DNA en el operador TRE, éste activa un promotor acoplado,
induciendo la transcripción del gen de interés.
En presencia de TC, tTa pierde afinidad por el operador y la transcripción se inhibe.
Estrategia experimental
Hepatoma 3B
transfección en medio con
tetraciclina
tTA + Gen reportero + Vector (WTs/ WTRes/
∆CTD)
actividad de luciferasa
Analizaron actividad de
luciferasa
Sistema inducible
¿Qué pasa con el activador utilizado en la construcción?
Activador débil
Activador fuerte
Efecto de ΔCTD sobre el nivel de inclusión de EDI
Hepatoma 3B
transfección en medio
con tetraciclina
tTA + construcción con minigen + Vector
(WTs/ WTRes/ ∆CTD)
RT-PCR
la inclusión de EDI aumenta en ausencia
de CTD (ΔCTD).
La inclusión es independiente del tratamiento con α-amanitina y se
ve favorecida por la ausencia de CTD.
¿Cuál es la intensidad de la inhibición llevada a cabo por α-amanitina?
Real time RT- PCR del RNAm maduro
Porcentaje de inhibición: 90%
Ahora se sabe que ∆CTD influye en el splicing alternativo, pero cómo lo hace?
Inhibición global de las reacciones de
procesamiento del RNAm
• capping
• poliadenilación
• splicing general
No se aprecian diferencias entre ∆CTD y
WTRes
El efecto de CTD sobre el splicing alternativo es independiente de su influencia
sobre los mecanismos globales del procesamiento del RNAm.
CTD esta compuesta por dos fracciones:
-Heptenas 1 – 25 (extremo N- terminal): esta compuesto
mayoritariamente de secuencias YSPTSPS.
-Heptenas 26 – 52 (extremo C- terminal): mayoritariamente
degeneradas.
-Rio abajo de la heptena 52 se encuentra un motivo de diez
aminoácidos (Cter) involucrado en la estabilización del CTD.
¿La composición de las secuencias heptaméricas del CTD
afectan al splicing de EDI?
Se transfectaron células Hep B3 con
construcciones conteniendo la Pol II
con fracción N- o C- terminal del CTD
y con o sin el motivo Cter.
• Pol II es estable con cualquiera de las dos fracciones siempre que estén
acompañadas por el motivo Cter. De lo contrario se degrada dando una forma de
180 kDa de menor posesividad.
Se evaluó el splicing de EDI utilizando los mutantes de CTD estables del
experimento anterior.
Ambas fracciones del CTD promueven el
splicing de EDI de igual forma que WT
res (rescate).
La función del CTD es independiente de
la composición de la fracción.
Estudios anteriores, habían producido CTDs con número variable
de heptenas. Esto ocurría a través de eventos de recombinación
que se daban durante la división celular.
¿El largo del CTD es importante para su rol en el splicing?
Se transfectaron células con diferentes construcciones y se evaluó el efecto
sobre la inclusión de EDI.
Se demostró la integridad de la proteína en las
células con las distintas construcciones.
Los CTDs cortos producían una alta inclusión de
EDI, aunque menor a la de ΔCTD.
A medida que aumentaba la longitud del CTD la
inclusión del EDI se restituía, disminuyendo
hasta los valores normales (WTres).
Una longitud mínima de 19 heptenas es necesaria para que se produzca el
splicing normal del exón.
La ausencia del CTD podría afectar el reclutamiento de factores de splicing de modo
de favorecer la inclusion del exón.
2 Hipótesis planteadas
La ausencia CTD
podría favorecer el
reclutamiento de
factores activadores
de splicing.
ó…
La ausencia del CTD
no permitiera el
reclutamiento de
inhibidores del
splicing.
La mayoría de los factores que afectan el splicing de EDI estimulan la inclusión
del exón. Siendo SF2/ASF el de mayor efecto activador.
Solo se conoce una proteína SR capaz de inhibir la inclusión de EDI, SRp20.
¿Qué efecto tiene la sobreexpresión de estas proteínas en el splicing de EDI?
Se transfectaron células con el
plásmido pSVEDA/FN solo o en
combinacion con vectores de
expresion para SF2/ASF o
SRp20.
La sobreexpresión de SF2/ASF aumenta la inclusion de EDI.
Esto se revierte al sobreexpresar SRp20
Sabiendo ahora lo que ocurre con la sobreexpresión, se decidió testear el efecto sobre el
splicing en el caso contrario, bajando los niveles de pt.
¿Qué es el RNAinterferencia?
Es un mecanismo que permite suprimir la expresión de genes específicos, impidiendo
la traducción de los mensajeros correspondientes. Esto se conoce como KNOCK DOWN.
Los principales actores son las moléculas de RNA interferentes. Las que hay de 3
tipos:
siRNA
Moléculas de ARN doble cadena de 20-30 nt. Tienen dos
nucleótidos desapareados (3´overhangs).
miRNA
ARN simple cadena de 21-25 nt. Son codificados
por el genoma.
piRNA
ARN simple cadena de 24-31 nt. Biogénesis y
mecanismo de acción poco conocidos.
El proceso de RNAi por siRNAs se puede
dividir en 5 pasos
1- Un ARN doble cadena que es expresado o introducido en la
célula, es procesado a smallRNAs (doble cadena) por DICER
(una RNasaIII-específicas de corte RNAdc)
2- El duplex es reconocico por un conjunto de proteínas que
promueve la separación de las hebras.
3- El complejo ribonucleoproteico ( o RISC, RNA-induced silencing
complex, contiene RNA guía) realiza una búsqueda del
transcriptoma (conjunto de ARNms de una célula en un
momento y condiciones dadas) para encontrar ARNms target.
4-El RNA guía dirije una endonucleasa llamada SLICER
(Argonauta, presente en el complejo RISC) para que clive al
ARNm.
5-Luego del clivaje, el ARNm ahora sin CAP ni cola POLY A es
degradado por la maquinaria de la célula.
¿Funciona el knock down de SF2/ASF y SRp20 con siRNAs para estas proteínas?
Prot. Endógenas con
anticuerpo anti la proteína
correspondiente.
siLuc como control negativo: si
no hay siRNA contra los
factores de splicing, estos
tienen que aparecer en el
Western blot. El sistema de
siRNA
no
interfiere
inespecíficamente.
Las abundancias de proteínas
SR fueron normalizadas a la de
ERK-2 (kinasa que participa en
la activación y proliferación de
Contra las recombinantes se linfocitos T).
usó un ab para su T7tag
El sistema funciona para ambos SRp, ya que estos logran inhibir tanto la
expresión endógena como exógena de la proteína blanco.
¿Qué efecto tiene el knock down de SF2/ASF y SRp20 sobre el splicing de EDI?
El knock down de SF2/ASF induce la
reducción de la inclusión de EDI,
tanto en presencia como en ausencia
del CTD.
SF2/ASF no actuaria interaccionando con CTD
El knock down de SRp20 aumenta la inclusión de EDI.
Este efecto se anula en ausencia de CTD.
SRp20 inhibe la inlcuisón de EDI
dependiendo de la presencia de CTD.
La inclusion de EDI estaría regulada, en parte, por un mecanismo que
implica el reclutamiento de factores de splicing mediado por la CTD.
Se sabe que CTD permite la unión de factores positivos y negativos para la elongación.
Además CTD es necesaria para la transición desde iniciación hacia la elongación.
¿Podría ser que los resultados observados con ΔCTD se deban a una menor elongación
por parte de la polimerasa?
No hay elongación normal en estos tratamiento
La ausencia de SRp20 sobre polimerasa defectuosas
para la elongación produce el mismo efecto que sobre
polimerasas WT.
El efecto observado de siSRp20 en ΔCTD (no aumenta
la inclusion de EDI) no se debe a una elongación
deficiente por parte de la polimerasa.
C4: polimerasa de elongación lenta.
CDK9 kinasa: fosforila la CTD en Ser2.
DRB: inhibe la CDK9 kinasa
El efecto de siRNA sobre EDI con ∆CTD se debe exclusivamente a SRp20?
Al deletar CTD el aumento de la inclusión es
mayor (5-7)que si solamente se trata con
siSRP20 células con WT res (5-6).
Si la interacción del CTD con SRp20 fuera la única
causa de la exclusión de EDI, el efecto observado en
las calles 6 y 7 debería ser el mismo.
Debe haber otro factor actuando en CTD que favorece la exclusión.
Proceden a realizar el mismo experimento que antes pero
cosechando las células a 96 hs después de la transfección, para
asegurarse de alcanzar un nivel de interferencia de SRp20
mayor.
Los niveles de inclusion son los mismos en ambos tratamientos.
Por lo tanto; la alta inclusion de EDI observada en mutantes ΔCTD puede atribuirse en
su totalidad a su incapacidad de mediar la inhibición provocada por SRp20.
Como se vio anteriormente (fig. 1) el efecto de ΔCTD sobre el splicing de EDI es
independiente del promotor.
Los experimentos de Knock Down se realizaron
siempre en sistemas inducibles, entonces...
¿Podría ser que el efecto del K.D. de SRp20 dependa de las características
del promotor?
¿Podría ser que el efecto del KD de SRp20 dependa de las características del
promotor?
Al realizar Knock Down de SRp20 cuando EDI estaba bajo el control de distintos promotores, se
que el efecto sobre la inclusión del exón era el mismo que el
observado en el sistema inducible.
Independientemente del promotor,
el K.D de SRp20 aumenta la inclusión de
EDI solo cuando la polimerasa tiene CTD.
Podría ser, que los niveles de inclusión de EDI cuando la polimerasa carece de ΔCTD
sean tan altos que impongan un umbral sobre el cual mayores incrementos se vean
obstaculizados.
Esto explicaría porqué al hacer K.D. de SRp20 en células con ΔCTD
no se observó un aumento en la inclusión de EDI
¿Realmente el efecto de SRp20 es dependiente
de la presencia de CTD en la RNA pol II?
¿Realmente el efecto de SRp20 es dependiente
de la presencia de CTD en la RNA pol?
Se diseño un sistema con el que se reducían los niveles basales de inclusión de EDI para
poder revelar si existen efectos de SRp20 independientes de ΔCTD
ΔESE
Mutantes con una deleción de la región
enhancer de EDI.
SF2/ASF pierde afinidad para promover la
inclusión de EDI.
Se comparó el efecto del KD de SRp20 partiendo de similares niveles basales de inclusión de
EDI.
Incluso a bajos niveles basales de inclusión, el KD de SRp20 no aumenta la
inclusión de EDI cuando la polimerasa es ΔCTD pero si cuando es WT.
Se confirman que el efecto de SRp20 en la inclusión de EDI depende de CTD. Y que los
niveles basales de EDI no inducen una inclusión diferencial por parte de ΔCTD.
Conclusiones:
•La transcripción por la RNA pol II mutante (ΔCTD) aumenta la inclusión
del exón EDI sin afectar la eficiencia general del splicing.
•El número de heptenas y no su composición es la causa de la
funcionalidad del CTD en el splicing de EDI. Siendo 19 la cantidad
mínima para una función normal.
•El aumento en la inclusión del EDI promovido por la proteína SF2/ASF
no se ve afectada por la deleción del CTD.
•La inhibición de la inclusión del EDI por el factor SRp20 depende
absolutamente del CTD.
•La acción de SRp20 mediante el CTD no depende de la tasa de
elongación de la polimerasa.
•El efecto producido por la ΔCTD en el splicing puede atribuirse por
completo a que la enzima es incapaz de mediar la inhibición por
SRp20.
•El mecanismo mediante el cual SRp20 inhibe la inclusión de EDI aún
no se conoce.
La tasa de elongación y el
reclutamiento de factores de splicing,
(el modelo cinético y el de
reclutamiento) contribuyen de manera
independiente al control
transcripcional del splicing alternativo.
EDI
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