Tópicos de Fisicoquímica en Sistemas Biológicos
Canales iónicos
Luciano Moffatt
INQUIMAE
16 de noviembre 2004
• Qué son los canales iónicos?
• Cuáles son sus roles fisiológicos?
• Cómo se los estudia?
Que son?
• Proteínas de membrana que tienen
permeabilidad selectiva por ciertos iones.
• Son multiméricas con varios dominios transmembrana
• Comprenden de:
–
–
–
–
–
Poro
Compuerta (gate)
Filtro (selectivity filter)
Sensor (voltage, neurotransmisor, etc)
Mecanismo de transduccion
Que no son?
• Transportadores (2 gates)
• Receptores metabotropicos (no
ionotropicos)
Bomba sodio
Ionotropico vs metabotropico
Que hacen?
• Son responsables de la permeabilidad
selectiva de la membrana
• Permiten cambios rápidos en la
concentración de iones (calcio) y del
potencial de membrana (transmisión de la
información a distancia).
Que no hacen?
• Mantener la concentracion diferencial
ambos lados de la membrana, esto lo
hacen las bombas
Como se los estudia
• Se mide la corriente que pasa a través de ellos.
Como solo se puede medir la corriente total, se
deben eliminar otros canales.
Dos estrategias
• Se buscan células que expresen el canal de
interés, los otros canales se bloquean
farmacológicamente
• Se usan células que expresen naturalmente
pocos canales, se sobre-expresa el canal de
interés. (Util para mutagénesis).
Como se los estudia
• Se miden diferentes parametros:
– Conductancia
– Permeabilidad relativa a distintos iones
– Probabilidad de apertura en distintas condiciones
• Se analiza la modulación por distintos factores
(potencial de membrana, concentracion de
agonistas, ph, concentracion de iones,
temperatura, etc)
• Se analizan transitorios y situaciones de steady
state
Sistemas de expresion
• Se tiene el gen o genes clonados y se los
expresa en algun sistema, tipicamente:
– Oocytos de Xenopus: se inyecta RNA.
– Celulas HEK-293: se transfecta con el
plasmido con un promotor fuerte. Se usa
lipofectamina.
Oocytos de Xenopus
• Lupa, no microscopio
• Expresion a 20C
• Corrientes grandes:
µA
• Aplicación lenta del
agonista (10ms-1s)
• Voltage clamp lento
Celulas HEK 293
• Mas parecido al
mamifero: expresion a
37C
• Microscopio
• Patch clamp: voltage
clamp rapido
• Uso de EGFP para
detectar la eficiencia de
la transfeccion
• Aplicación del agonista
hasta 100µs
Sistemas nativos
• Cultivos primarios: modificaciones posttraduccionales, distribucion celular
• Fetas de tejidos (slices): conexiones
sinápticas
• In vivo: patrones de actividad sinaptica
Voltage clamp
voltage clamp vs current clamp
• Voltage clamp: como las propiedades del
canal dependen del potencial de
membrana, conviene mantenerlo
constante.
• Current clamp: estudiar los canales en un
contexto natural
Modelo RC de la membrana
• Capacidad de las membranas:
0.01pF/µm2
• Densidad de canales: 1-1000/µm2
• 1 canal-0.5ms
• En voltage clamp a Vm=cte la capacidad
de la membrana no influye
• Se corrige la capacidad para saltos de Vm
Patch
clamp
• Gigaseal
• Canal
unico
Whole cell vs patch
• Whole cell: mas fisiologico.
• Isolated Patch: mas versatil (1 µm2)
Canal unico
Equipamiento
Amplificador de patch
Ejemplo de estudio de canal
unico
Estrategia de analisis cinetico
• Obtener datos de canal unico y/o de
macrocorrientes en distintas condiciones
de Vm, concentracion de agonista, etc
• Proponer un modelo cinetico markoviano
• Optimizar los parametros del modelo que
minimicen la suma de los cuadrados de
los residuos.
• Si la prediccion no resulta buena cambiar
el modelo cinetico.
Modelos cineticos
• Ver apunte de Sigworth
Ejemplo de modelo cinetico
Ejemplo de estudio de
macrocorrientes
B
A
100%
100%
100 ms
1 ms
100%
100%
D
C
100%
100%
100 ms
100%
100%
1 ms
A Scheme I
C1
C2
3kon
C3
C4
2kon
koff
kon
2koff

O5

3koff
B sub-Scheme Ia
C1/2/3
C4

O5

3koff
C sub-Scheme Ib
C1
C2
3kon
C3
2kon
C4
kon
D Scheme II
C1
C2
3kon
C3
2kon
koff
C4
kon
2koff
F5
k+
3koff
3k-

O6

Alosterismo
Scheme III
O9
O10
3K
-1
EB
C1
-3
F5
-1
FA B C2
3K
O13
E
-2
-1
FA B C4
1/3K
2KA
E
FB
F O16
1/2KA
-1
F7
EB
-1
FA O15
2KA
-2
-3
3KA
EB
C3
EB
FA O14
3KA
F6
1/3K
-1
FA B
K
E
O12
K
EB
-3
EB
FA
O11
F8
1/2KA
E
SCHEME IVB
O11
C1
EB
-3
3K
O12
3K
EB
C2
O13
K
-3
-3
FB
K
EB
C3
F5
3FB
O16 3F
2K
-2
-3
EB
2FB C4
1/3K
O15 2F
F
2K
F6
EB
-2
EB
1/2FB F7
1/2K
O18
1/2F
FB
O19
F
K
-1
F8
O17
1/2K
-2
EB
O14
1/3K
-1
EB
K
F9
EB
1/3FB
O20
1/3F
F10
E
Performance de modelos
100
IV I
II
II
decay(ms)
rise (ms)
1
III
I
IV
III
0.1
10
0.01
0.1
1
0.01
0.1
Applied ATP (µM s)
Applied ATP (µM s)
0.35
1
0.30
III
II
0.1
delay (ms)
Normalized Amplitude
1
II, 2 steps
0.01
0.001
IV
III
II
I
0.01
0.25
0.20
IV
I
0.15
II, 4 steps
0.10
0.1
Applied ATP (µM s)
1
0.05
0.01
0.1
Applied ATP (µM s)
1
Resumen
• Mediante los modelos cineticos se puede
describir y predecir cuantitativamente el
comportamiento de un canal en condiciones
arbitrarias de los factores que definen su
comportamiento (Vm, concentracion, etc)
• El paso siguiente hacia arriba es construir una
celula virtual donde se puede predecir la
interaccion entre distintos canales
• Para abajo se puede tratar de determinar la
base estructural de las diferentes constantes
cineticas obtenidas.
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Canales ionicos de membranas exitables