Interacción Primaria
Enzimoinmunoanálisis (EIA)
Radioinmunoensayo (RIA)
Inmunofluorescencia (IFI, IFD)
Comisión 4 – Año 2013
Interacción
primaria
Características
Interacción
secundaria
Interacción simple Ag-Ac
Formación de complejos
macromoleculares
NO VISUALIZABLE
VISIBLES
MACROSCOPICAMENTE
Factores que la condicionan
POCA INFLUENCIA DE
LAS CONDICIONES DEL
MEDIO
DEPENDEN DE TEMP Y FZA
IONICA (cc de sales)
Tipo de Ag y Ac
involucrado
Ag y Ac monovalentes o
polivalentes
Ac MINIMO bivalente
Ag polivalente/particulado
NO IMP VALENCIA
VALENCIA > o = 2
MAYOR
MENOR
Sensibilidad
Interacción primaria
Es la unión entre un epítope y un paratope.
Ac + Hp
k1
k-1
AcHp
La interacción entre el epitope y el
paratope obedece a la ley de acción
de masas.
Es una reacción de equilibrio
Cuanto más ac agregue a mi muestra mas complejo se formará y más
podré detectar
Esta interacción está principalmente influenciada por la temperatura
A mayor T°, menor tpo preciso
Parámetros de la Interacción Primaria
Afinidad- Avidez
Afinidad: es la fuerza de unión o reacción entre un solo sitio de
combinación del anticuerpo (paratope) con un solo determinante
antigénico (epitope).
Es la sumatoria de fuerzas de atracción y repulsión entre ellos.
Avidez: es la fuerza total de unión de antígenos multivalentes con
anticuerpos multivalentes.
EIA
Componentes de los EIA (Enzimoinmunoensayos)
• Componente Incógnita (puede ser Ac o Ag)
• Componente que se una al incógnita
(puede ser Ac o Ag)
Interacción
Primaria
• Componente que revele dicha interacción
(en los EIA se une una Enzima, se le agrega el
sustrato y da un producto CROMOGENICO)
• Se mide el color por Densidad Óptica
Clasificación de los EIA
Homogéneos
En fase líquida
Heterogéneos
empleando un soporte en
fase sólida para inmovilizar
uno de los inmunoreactantes.
Ej: ELISA
De amplificación de actividad
NO COMPETITIVOS
De modulación de actividad
COMPETITIVOS
EIA
(Enzimoinmunoensayo)
• Se basan en:
- La elevada especificidad de los Ac
- La alta actividad de algunas enzimas lo que
permite la señal generada por la muestra.
- Dos etapas grales:
- La rx de un inmunoreactante con un ag o un ac
- La detección de ese inmunoreactante mediante
la utilización de un conjugado enzimático.
1er Caso
EIA homogéneo
Do
Hp
Hp
título
2do Caso
Do
Hp
Hp
Cc de Ag.
EIA homogéneo
• En el 1er caso, el Hp está conjugado con
la enzima. El OBJETIVO es determinar el
titulo de un Ac específico. La presencia del
mismo en la muestra al unirse al Hp,
inhibirá la actividad de la enzima. Por
tanto, disminuirá la DO cuanto mayor sea
el título.
• Como obtengo el título?
EIA homogéneo
No es necesario separar los complejos Ag-Ac del antígeno
libre.
• Importante! El Ac debe cambiar la actividad de la enzima.
• Como el ag marcado y la muestra se incuban juntos, esta
última no puede contener isoenzimas, sustratos o
inhibidores enzimáticos.
• Los Hp deben ser de tamaño pequeño, asi la interacción
enzima-Ac no son afectadas por el ag.
Usos: Ej - cuantificación de T4
EIA homogéneo
Variante competitiva
Hp
Muestra
incógnita
Hp
Hp
Hp Hp
Hp Hp
Hp
Do
Por que no usar la variante
anterior para cuantificar hapteno?
Porque no tengo Ac específico marcado con enzima.
Cc. de Ag
Clasificación de los EIA
Homogéneos
En fase líquida
Heterogéneos
empleando un soporte en
fase sólida para inmovilizar
uno de los inmunoreactantes.
Ej: ELISA
De amplificación de actividad
NO COMPETITIVOS
De modulación de actividad
COMPETITIVOS
Competitivo…
Suero problema
S
P
Do
Ac conjugado
Ag sensibilizante
título
En el 1er caso, el OBJETIVO es determinar el
título de un Ac específico.
Para esto se sensibiliza una placa y se incuba
la muestra incógnita con un Ac específico
marcado.
Cuanto mayor sea la señal, menos Ac en la
muestra.
Competitivo…
Ag conjugado
Do
Ag a determinar
Ac captura
Cc ag
En el 2do caso, el OBJETIVO es determinar un ag.
Entonces, se sensibiliza la placa con un Ac de captura y compite el ag
marcado con enzima y el ag sin marcar de mi muestra incógnita.
Cuanto mayor sea la señal, menor cantidad de dicho ag en la muestra.
No competitivo…
S
P
Indirecto
Do
Ac conjugado
Suero problema
Ag sensibilizante
título
En el 1er caso, el OBJETIVO es determinarr un Ac específico en una suero problema.
Entonces sensibilizamos una placa con ag específico, incubo con la muestra, lavo,
agrego el conjugado.
No competitivo…
S
Sandwich
P
Do
Ac conjugado
Ag a determinar
Ac captura
cc del Ag
En el 2do caso, el OBJETIVO es determinar un ag.
Asi sensibilizo la placa con un Ac específico, incubo con la muestra, lavo,
agrego el conjugado.
Mejor si ambos Ac son de la misma especie para evitar reactividad
cruzada.
Addemás tener en cuenta que sean específicos para distinto epitope, sino
no se va a unir el congujado porque va a estar unido al sensibilizante.
Como obtengo la curva?? Con diluciones
seriadas de un ag de concentración
conocida y los demás componentes del
sistema constantes
Do
Do
Cc ag
COMPETITIVO
Cc del Ag
NO
COMPETITIVO
Entonces…
ELISA no competitivo
ELISA competitivo
Inmovilización del inmunoreactante (Ag o Ac) a la
fase sólida
Bloqueo
Incubación con el patrón Incubación con el ag
y/o la muestra
marcado así como con
el patrón y/o la muestra
Incubación con el Ac de
detección
Revelado (reacción colorimétrica)
Puesta a punto de la
técnica…
Sensibilización de la placa
Materiales más usados (PVC y
poliestireno).
Que ag? ADN, proteínas y
oligopéptidos, células enteras
Bloqueo
Lavados
• Se eliminan componentes libres o unidos
de manera no específica al
inmunoreactante inmovilizado en la placa.
• Se utilizan soluciones salinas isotónicas
(misma cc de solutos afuera que adentro
de las celulas, ej.PBS) suplementadas con
detergente (para impedir interacciones
hidrofobicas inespecificas , ej.Tween 20).
Titulación del conjugado
Dil conj 1/400
1/800
1/1600
1/3200
suero
Positivo fuerte
++++
+++
++
++
Positivo débil
+++
++
+
+/-
negativo
++
+
-
-
Cc óptima de
conjugado
Revelado
Se pueden emplear:
• Peroxidasa de rábano (Oxidación)
2 DH + H2O2  2H2O + 2D- COLOR!!
Donante de H: OPD (490nm)
• Fosfatasa alcalina (Desforforilacion)
sustrato: p-nitro fenil fosfato  p-nitro fenol
(405nm) COLOR!!
Controles
Control Positivo
Suero
especifico
Control de inespecífico:
Control Negativo
Suero no
inmune
Blanco:
+
OPD
Aplicaciones
• Cualitativas:
– Determinar la presencia de Ac específicos
– Determinar la presencia de ag en una
muestra
• Semicuantitativas:
– Titulación de Ac específicos
• Cuantitativas:
– Determinar la cc de un antígeno en una
muestra
Procesamiento de datos
y
expresión de resultados en ensayos
inmunoenzimáticos
SENSIBILIDAD
Es la medida de la habilidad del ensayo de
mostrar como positiva a una muestra que
realmente lo es aun cuando esta presente bajas
cantidades del componente incógnita.
La capacidad de no producir falsos negativos.
ESPECIFICIDAD
Es la medida de la habilidad del ensayo de
mostrar como negativa a una muestra que
realmente es negativa.
La capacidad de no producir falsos positivos.
Cálculo del valor de corte (cut off)
Se construyen curvas para un gran número de
sueros negativos y se grafica frecuencia (f) vs DO.
f
Mtras
(+)
Mtras
(-)
x
Se calcula
la media y
el DS:
DO
2SD3SD
Cut off
X+2DS
X+3DS
cut off si la DO es menor a este valor el suero es
negativo con un 95 % de certeza (van a haber falsos
positivos) alta sensibilidad
si la DO es menor a este valor el suero es negativo con un
99 % de certeza (van a haber falsos negativos)  alta especificidad
Ensayo cualitativo (detección de Ac)
Se pone una única dilución del suero y se
mide la absorbancia, se informa como
positivo si cae por encima del cut off.
Ejemplo:
Abs 1: 0,208
Abs 2: 1,034
Abs 3: 2,023
Cut off: 1,090
Ensayo semicuantitativo
Se hacen diluciones seriadas del suero a
valorar y se grafica DO vs dil suero. El título
es la inversa de la última dilución que
desarrolla una DO mayor al cut off
DO
Frec
Mtras
(+)
Mtras
(-)
Cut
off
DO
Titulo
Dil suero
x
Ensayo cuantitativo
Se determina la cc de ag por comparación
con una curva patrón.
DO
DO incógnita
cc
muestra
cc antígeno
patrón
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