La creación de capacidades para el desarrollo
de nuevos compuestos terapéuticos para la
enfermedad de Chagas en El Salvador.
JICA - JSPS - MINED
06/08/2011 - 05/08/2013
Sobre este proyecto
Este proyecto con CICES(MINED) y JICA tiene
como objetivo general aumentar la capacidad de
investigación básica para encontrar un nuevo
compuesto.
El período es del día 06 de agosto de 2011 al 05
de agosto de 2013.
Para el tratamiento de la enfermedad de Chagas
hay que desarrollar un nuevo fármaco para lo que
se necesita encontrar un compuesto.
Sobre este proyecto
Generalmente, hay dos maneras:
1. Encontrar un compuesto para el tratamiento de
Trypanosoma cruzi (T. cruzi).
→ Este método, después de encontrar un compuesto, hay
necesidad de asegurarse de que haya un efecto sobre
T. cruzi.
2. Encontrar una enzima decidida de antemano.
→ Este método, si la enzima está únicamente en T. cruzi ,
las reacciones adversas pueden ser reducidas en las
personas.
Objetivos específicos:
1. Preparar un ambiente de cultivo para T. cruzi, y aprender el
subclutivo.
Aprender el método experimental para determinar el efecto del
reactivo sobre el T. cruzi.
2. Aprender el manejo de la enzima y la purificación a gran escala
de la TcDHOD, la cual es una proteína diana, decidido de
antemano.
Aprender el método experimental para confirmar el efecto del
reactivo sobre la TcDHOD(experimentos de inhibición).
3. Preparar el ambiente del laboratorio de cada trabajo.
Y lo que maneja cada una de las investigadoras.
Sobre TcDHOD
La proteína diana TcDHOD (dihidroorotato
deshidrogenasa) es una enzima esencial para
el crecimiento de T. cruzi.
Cuando se inhibe la actividad, T. cruzi se muere.
Por eso, TcDHOD es necesaria para que
T. cruzi pueda vivir.
Estructura dimérica de TcDHOD
Enzima citplasmática
C
N
DHO
FMN
FMN
DHO
N
C
Inaoka et al., Biochemistry, 47, 10881-10891, 2008
Sobre TcDHOD
La proteína diana TcDHOD (dihidroorotato
deshidrogenasa) es una enzima esencial para
el crecimiento de T. cruzi.
Cuando se inhibe la actividad, T. cruzi se muere.
Por eso, TcDHOD es necesaria para que
T. cruzi pueda vivir.
Ambiente del Laboratorio
La preparación del ambiente del laboratorio del
CICES se hace en cooperación con Ministerio
de Educación(MINED).
Para la instalación del laboratorio, MINED ha
asegurado para CICES un espacio en
CENSALUD de UES.
La preparación del ambiente de laboratorio
y el trabajo de los experimentos se realizan en paralelo.
Ambiente del laboratorio
Laboratorio de CICES
Los experimentos
1. Cultivar T. cruzi en forma de epimastigote y
realizar el experimento de inhibición.
2. Experimentos con la proteína(enzima) TcDHOD.
Manejo de la expresión y purificación de la TcDHOD.
3. Manejo de genes.
Esto es extracción de gen y manejo del PCR.
1. Experimento de T. cruzi
1. Experimento de T. cruzi
Método de cultivo de T. cruzi epimastigote.
T. cruzi CL Brener es un tipo de cepa de T. cruzi.
He traído el epimastigote de Japón.
(図:NCBI gene)
1. Experimento de T. cruzi
Hacer el medio:
LIT medio pH 7.2
La esterilización se debe hacer usando un filtro.
Composición:
Infusión de Caldo de Hígado, Triptosa, NaCl, Na2HPO4, KCl, Glucosa,
Suero Bovino Fetal y Haemin.
1. Experimento de T. cruzi
El cultivo se hace a 25 grados centígrados.
Esto se debe a que es la temperatura
aproximada del cuerpo de la chinche.
T. cruzi epimastigote
1. Experimento de T. cruzi
Método de subcultivo:
→ contar las células
Cámara de recuento
1. Experimento de T. cruzi
Experimentos de inhibición
El experimento de inhibición, se ha hecho con
unos compuestos que he traído de Japón.
MII-5-170
MII-6-040
1. Experimento de T. cruzi
Método:Determinar crecimiento en 24 horas
después de la adición.
DMSO (dimethyl
sulfoxide)
Benznidazole
MII-5-170
MII-6-140
T. cruzi epimastigote
Concentración final
0.1%
10μM
10μM
10μM
Total 100 μl
200×104 celulas/ml
1. Experimento de T. cruzi
Resultado:Determinar crecimiento en 24 horas
después de la adición.
DMSO (dimethyl sulfoxide)
Benznidazole
MII-5-170
MII-6-140
La tasa de supervivencia
90.1 %
87.8 %
52.8 %
(Trabajo de Karla y Maricela)
2. Experimento con la proteína
2. Experimento de la proteína
Método de expresión TcDHOD:
Escherichia coli TcDHOD es utilizada para la expresión
del TcDHOD, la traje de Japón.
sin His tag y con His tag
Para expresar la proteína siempre se utiliza E. coli.
2. Experimento de la proteína
BL21(DE3)/pTcDHOD Cultivo en 200 mL de LB medio
25 ℃
(1)
La inducción por IPTG 1 mM
kDa
sonicación
(4)
21882 x g, 10 min, R.T
50
(2)
Sobrenadante
(citoplasma)
(3) DEAE Sepharose Fast Flow
(4)
Phenyl Sepharose
High Performance
40
(4) Muestra el resultado
de la columna de Phenyl.
12% SDS-PAGE, Tinción
de Azul de Coomassie.
Peso molecular del
TcDHOD es de 34 kDa.
30
(Trabajo de Karla y Maricela)
El flujo del experimento es como este gráfico.
2. Experimento de la proteína
Abs.
El Resultado de la actividad de TcDHOD a través
de la columna Phenyl HP.
La actividad de TcDHOD
32.1 mg /min / ml
(Trabajo de Karla y Maricela)
2. Experimento de la proteína
BL21(DE3)/pTcDHOD con His tag .Cultivo en 200 mL de LB medio
25 ℃
(1)
La inducción por IPTG 1 mM
kDa
sonicación
(4)
21882 x g, 10 min, R.T
50
(2)
Sobrenadante
(citoplasma)
40
30
(3) DEAE Sepharose Fast Flow
(4)
His Trap Fast Flow
(4) Muestra el resultado
de la columna de His Trap
FF. 12% SDS-PAGE,
Tinción de Azul de
Coomassie.
(Trabajo de Karla y Maricela)
2. Experimento de la proteína
Experimentos de inhibición
El experimento de inhibición, se ha hecho con
unos compuestos que he traído de Japón.
MII-5-170
MII-6-040
3. Manejo de los genes
3. Manejo de los genes
Manejo del PCR.
Primer para TcDHOD lo he traído
de Japón.
3. Manejo de los genes
La electroforesis con agarosa
Confirmar en el UV
Plan de acción
El laboratorio de CICES tiene capacidad para cultivar
T. cruzi y microbio, para trabajar proteína y gen.
En otras palabras, podemos hacer el experimento
básico y el diagnóstico genético.
En el futuro, hay experimentos que se considerarán
para desarrollar más investigaciónes.
Plan de acción
1. Confirmar el efecto de inhibición utilizando extracto y
compuestos o sintetizados que se obtenengan El
Salvador que se necesiten para el desarrollo del nuevo
fármaco.
Si hay una muestra que tiene posibilidad de efecto,
se puede purificar.
Y, si una muestra purificada es efectiva,
se identifica el compuesto.
¿Compuesto?
Plan de acción
Si se encuentra el compuesto terapéutico, hay muchas
posibilidades de desarrollo de nuevo compuesto.
¿Compuesto?
↓
Medicina
Plan de acción
2. Uso del PCR
Hacemos extracción del gen, y utilizamos el PCR para
aplicar a los estudios, los análisis clínicos y
epidemiológicos.
En este momento, MINSAL y CICES trabajan un
proyecto de Chagas en conjunto.
Esta tecnología debería ser de beneficio para los
pacientes.
Conclusión
El laboratorio de CICES tiene capacidad para hacer
desde el experimento básico al epidemiológico.
Desde ahora, me gustaría trabajar en colaboración con
el MINSAL y otras instituciones de investigación junto
con el laboratorio de CICES para beneficio de todos.
Y con el tiempo, deseo que la investigación básica sea
conjunta.
Puede ser a nivel de toda la región centroamericana,
siendo El Salvador el eje principal.
¡Muchas Gracias!
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