Identificación de subproductos y posibles daños celulares en Helicobacter
pylori por acción del cloro y el ozono en agua potable.
Jefe de proyecto: Ma. Teresa Orta de Velásquez
Participantes
Académicos: M. en C. Isaura Yáñez Noguez, Dr. Ignacio Monje Ramírez,
Fac. de medicina: Dra. Yolanda López Vidal, Dr. Gonzalo Castillo
Becarios:
Maestría.
Beatriz Casasola Rodríguez
Licenciatura. Priscila Ivette Román Román
Marié Andreé Pierdat Gallardo
Salvador Rangel Guadalupe
Proyecto Interno: 9361
Vigencia: 2010-2011
• Helicobacter pylori
Helicobacter pylori es una bacteria asociada a gastritis crónica y adenocarcinoma.
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GRAM (-)
2-6 FLAGELOS UNIPOLARES
2 FORMAS MORFOLÓGICAS (COCOIDE, BACILAR)
FORMA COLONIAS TRANSLUCIDAS DE 1 mm
MICROAEROFÍLICA
(2-5% O2 Y 5-10% CO2) EL O2 ES SU ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES
TEMPERATURA ÓPTIMA 37 º C
NEUTRÓFILA CON CRECIMIENTO ÓPTIMO PH: 5.5-8
REQUIERE MEDIOS COMPLEJOS, COMPLEMENTADOS CON
AGAR SANGRE Y SUPLEMENTOS DENT Y SKIRROW
ES DETECTADA AL AGREGAR TRIFENILTETRAZOLIO (TTC)
UREASA, CATALASA Y OXIDASA (+)
CATABOLIZA GLUCOSA SOLAMENTE
AMINOÁCIDOS Y UREA, FUENTE DE NITRÓGENO
Debido a su importancia, ha cobrado interés a nivel mundial:
En 1994 (IARC) y (OMS), lo clasificaron como carcinógeno de clase I dentro de los agentes causales.
2005 Marshall y Warren obtuvieron el premio nobel en medicina por el descubrimiento de
la implicación de la bacteria en úlceras pépticas y gástricas.
*OMS 2008
México
Mundial
• 50% de la población mundial está
infectada
• 80% en países en desarrollo
• Infectados con H. pylori
• 20% desarrollará cáncer
gástrico
• 20% desarrollarán úlcera
péptica.
Formas morfológicas transmisibles de H. pylori
Bacilar
En cuerpo humano y
condiciones de
laboratorio
Viable , Cultivable.
Apta para pruebas
médicas
•
Cocoide
Forma resistente en el
ambiente acuático
Viable no cultivable
(VNC)
Apta para pruebas de
desinfección en
condiciones naturales
No viable
Azevedo et al. 2007 proponen que la forma cocoide es la forma en la que la
bacteria se encuentre en el medio ambiente
Detección
•
Debido a que la forma (VNC) es la que se encuentra
presente en los sistemas acuáticos, se utilizan diversos
métodos que no involucran el crecimiento de la bacteria.
• Inmunoensayo enzimático
• Prueba de actividad de ureasa
• Hibridación fluorescente in situ FISH:
(Fluorescent In Situ Hybridization)
• PCR (polymerase chain reaction) en tiempo real
- PCR Técnica cuantitativa
- PCR Detecta en tiempo real la amplificación de nuestro genoma de
interés.
Se ha detectado HELICOBACTER PYLORI en:
•Agua superficial (Cutzamala).
•Agua residual tratada usada para riego (Xochimilco).
•Agua residual sin tratamiento (Gran Canal/Río de los Remedios).
Métodos más empleados para Desinfección
• Cloro
•
• Ozono
Hipoclorito y monocloramina (NH2Cl)
• Económico y eficaz
• Buenas propiedades residuales
• 1.1 mg/L residual
• Alto potencial de oxidación
• Rápida descomposición
• 0.1-0.4 mg/L residual
• Formación de trihalometanos en
presencia de materia orgánica
(vegetal o animal)
- Bromoformo
- Cloroformo
• Formación de subproductos en
presencia de materia orgánica y
bromuros.
-Bromato (25 μg/L)
-Bromoformo
Desinfección
H. pylori ha mostrado resistencia a los niveles
habituales de cloro, por lo que la bacteria puede
permanecer viable el tiempo suficiente para llegar a
la población.
Daño en membrana
Buscar alternativas eficaces en los
procesos de tratamiento de agua
potable y de reuso.
El tratamiento con ozono es una
tecnología factible de desinfección
(Thanomsub 2002). Usó cultivos
aplicando altos tiempos de contacto.
OBJETIVO
Establecer las dosis del ozono y cloro, así como tiempos de contacto necesarios para
inactivar la bacteria H. pylori inoculada en una muestra sintética y en agua de pozo.
Objetivos específicos:
1. Cuantificar la densidad celular de H. pylori, para determinar la inactivación
aplicando la técnica de PCR en tiempo real.
2. Determinar posibles alteraciones en el DNA de H. pylori aplicando la técnica
de PCR el tiempo real.
3. Determinar posibles alteraciones en la estructura celular de H. pylori por
medio de microscopía electrónica.
4. Evaluar subproductos derivados de la desinfección con ozono .
METODOLOGÍA
Suspensión bacteriana
En agua
13 ml de agua
6x106 UFC de H. pylori
Concentración conocida
con PCR-tiempo real
Micrografía electrónica
3 min 5 min 10 min
Medición de
concentración de la
densidad
con PCR-tiempo real
Desinfección con cloro
y ozono
Medición de
subproductos por
cromatografía de gases
Daño en membrana
Micrografía electrónica
Resultados
Determinación de la solubilidad del
ozono en agua destilada
Para realizar los ensayos de desinfección
fue necesario obtener una solución
acuosa saturada de ozono, ya que no es
posible ozonizar directamente las
muestras sintéticas con H. pylori. Debido
a que se trabaja con volúmenes muy
pequeños de agua y las dosis de ozono
son bajas.
Se realizaron diferentes
ensayos, sin embargo no
se observó crecimiento
bacteriano en ninguna de
las placas de agar.
Probablemente
la
bacteria sufre lisis por
choque osmótico al
entrar en contacto con
el agua destilada.
Se efectuó el mismo
ensayo, sustituyendo el
agua
destilada
por
Solución Salina Isotónica
para determinar tiempo de
vida de la forma bacilar de
H. pylori en ella, sin
embargo
tampoco
se
obtuvo crecimiento de H.
pylori en ninguna de las
placas. Se determinó un
tiempo de vida corto de la
forma bacilar de H. pylori
en agua destilada.
El Dr. Castillo de la
Facultad
de
medicina
recomendó promover las
formas cocoides y realizar
los
ensayos
de
desinfección dentro de un
periodo
de
22
días
posteriores.
Debido a los resultados obtenidos
se evaluó la posibilidad de
trabajar con las formas cocoides,
ya que estas son las que se
encuentran en medios acuáticos
como forma de resistencia de la
forma bacilar de H. pylori.
RESULTADOS
Obtención de las formas cocoides
Helicobacter pylori será proporcionada por la Facultad de Medicina
(UNAM. 26695)
Suspensión celulares con 3x105 UFC/mL
Bacilar
Se incubó a temperatura ambiente en condiciones aeróbicas para inducir la
transformación de las formas bacilares a formas cocoides.
Cocoide
Se realizaron tinciones de Gram de las 3 suspensiones a los 5, 6 ,7 y 10 días. En todos los
casos se observaron formas bacilares y formas cocoides, pero las estructuras cocoides
fueron aumentando progresivamente y cada vez se observaron menos formas bacilares.
Al décimo día se obtuvo una suspensión que contiene más del 80% de las
formas cocoides. (Tinción Gram)
Con esta suspensión se pretende trabajar para realizar los ensayos de desinfección.
Los resultados que se obtengan serán de mayor relevancia debido a que las
formas cocoides de Helicobacter pylori juegan un papel importante en el proceso
de transmisión por su capacidad de persistencia en ambientes acuáticos.
ACTIVIDADES SEGUNDO AÑO
Suspensión bacteriana
FORMAS COCOIDES
Concentración inicial con
PCR-tiempo real
Desinfección con cloro y
ozono
Medición de concentración
con PCR-tiempo real
Medición de subproductos
por cromatografía de gases
Micrografía electrónica
Daño en membrana
Genotoxicidad
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