Vías de muerte
caspase
cysteine-dependent aspartate specific protease
 Especificidad dominante para sustratos
conteniendo Asp (específico de caspasas)
Excepción: Granzima B: activador de caspasas
 Contienen un pentapéptido conservado: QACXG
conteniendo la cisteína del sitio activo (común en
cisteína proteasas)
Horvitz y cols.: Caenorhabditis elegans
CED 3
CED4
CED9
CED 3: proteína pro-apoptótica con homología de
secuencia con:
interleukin-1-converting enzyme (ICE)-like proteasas
pro-IL-1
IL-1
por clivaje entre Asp 116-Ala 117.
Para unificar la nomenclatura: CASPASAS
Caspasa 1: primera caspasa identificada (la
numeración de los aácidos de todas las caspasas se
refiere a ella)
Procesamiento de caspasas
* Residuos esenciales para la catálisis
 Residuos para reconocimiento de sustrato
Interrogantes acerca de la función de algunas
caspasas
* Caspasa 2: iniciadora vía TNFR
* Caspasas 4,5 y 13: rol desconocido
Se las agrupa como activadoras de Citoquinas por su
similitud con la secuencia con caspasa 1
Pero: caspasa 13 es activada por caspasa 8??
Significado fisiológico desconocido
Estructura primaria de las caspasas
Estructura primaria de caspasas
La familia de las caspasas
Activación de las pro-caspasas 7 y 9
Sustratos de caspasas
Caspasas activ. de citoquinas (1, 4 y 5):(W/Y)EHD
Caspasas iniciadoras (8, 9 y 10): (I/L/V)EHD
Caspasas ejecutoras (3 y 7) y caspasa 2: DEXD
Uso de sustratos selectivos en mezclas de caspasas
Es complicado
La actividad y abundancia de cada caspasa, determina el
resultado. La estructura ternaria es relevante
Sustratos de Caspasas
Elementos del citoesqueleto: actina, fodrina, proteína
tau y catenina
Enzimas encargadas de reparar (PARP) o degradar
(DNAasa) el DNA
Factores de transcripción: Rb, MDM2
Proteínas quinasa y fosfatasas: PKC, fosfatasas 2-alfa,
Akt
Productos de la familia Bcl-2
CAD-ICAD
Sustratos de caspasas
Sustratos e inhibidores de caspasas
Estructura de las caspasas
Heterodímeros: cada uno contiene un sitio catalítico
compuesto por residuos de ambas subunidades
Cada sitio activo contiene un S1 (+)(altamente
conservado) para unir el Aspartato P1 (-) del
sustrato
P2 y P3 tienen un efecto limitado sobre el clivaje del
sustrato
P4 y S4 son relevantes en la especificidad por
sustrato
Sustratos sintéticos
Secuencia tetrapeptídica de preferencia de caspasas
Sustratos sintéticos: tetrapéptidos conjugados a:
1) un cromóforo pNA (espectrofotometría)
2) un fluorocromo: AMC (7-amino-4-metilcumarina)
AFC (7-amino-4- trifluorometilcumarina)
(espectrofluorometría)
La secuencia tetrapeptídica es una secuencia de
“preferencia” y no absoluta
Muchas caspasas pueden clivar el mismo sustrato
“in vitro” aunque con distinta eficiencia.
La elección depende de la concentración, tiempo de
reacción y accesibilidad
Inhibidores Sintéticos
Se unen al sitio activo de las caspasas en forma
reversible o irreversible
Algunos forman uniones covalentes con la cisteína
del sitio activo
Bloquean o retrasan la muerte
Pueden ser tóxicos para la célula (incub. t largos)
Como ocurre con los sustratos de caspasas, los
inhibidores no son específicos para una caspasa
Otros roles de las caspasas
• Regulación de la diferenciación celular: FADD es
un regulador clave del desarrollo de células T
• Proliferación celular ( de células T) y progresión
del ciclo celular
• Motilidad celular
• Internalización de receptores (FAS R)
Mecanismos de activación de caspasas
Homoactivación: requiere del reclutamiento de
zimógenos a proteínas adaptadoras:
caspasas iniciadoras 8 y 10: DISC, mediado por R
de muerte
caspasa iniciadora 9: Apoptosoma, compuesto por
Apaf1, citocromo c, dATP/ATP y caspasa 9
Heteroactivación: ocurre por acción de otras proteínas
sobre los zimógenos caspasas
Dominios de Apaf-1
Card: se une al Card de caspasa 9
NBD: dominio de unión a nucleótidos, involucrado
en la oligomerización
WD40: involucrados en interacciones proteínaproteína
* El dominio CARD no está normalmente expuesto
y no se une a procaspasa 9 a menos que Apaf1 sea
activado por dATP y citocromo c
* El acceso al dominio CARD está normalmente
bloqueado por las WD40
* ATP y cit.c hacen que Apaf-1 sufra un cambio conformacional que expone el dominio CARD uniendo
luego la pro-caspasa 9
Apoptosoma: la rueda de la muerte
El sitio de unión para Cit. c con Apaf-1 no ha sido caracterizado
WD-40 regulan el sitio de unión
La unión de Cit. C expone los sitios de unión para dATP
La homodimerización parece ser la clave para la
activación de la procaspasa 9
Un evento único es que sólo uno de los dos polipéptidos se vuelve activo
Probablemente los monómeros de procaspasa 9
unidos al apoptosoma recluten nuevos monómeros
de procaspasa 9 para formar la holoenzima
El apoptosoma permitiría la interacción antiparalela
de dos monómeros inactivos para formar el dímero
asimétrico activo
Interacciones caspasa 9-apoptosoma
Caspasa 9 libre: actividad mínima
el
apoptosoma actúa como holoenzima
La actividad del zimógeno y la forma procesada
aumentan 2000 veces por unión al apoptosoma
Estequiometría Apaf-1/caspasa 9: 1:1
El procesamiento proteolítico en el linker no es
necesario para la activación de caspasa 9
El dominio N-terminal no se corta, la caspasa puede
permanecer asociada al apoptosoma y activar casp.
ejecutoras
Vias de muerte
Niveles de regulación de las caspasas
Hay precursores de caspasas expresados en forma
constitutiva
deben estar estrechamente
reguladas
1) Los precursores de caspasas están presentes en
una conformación que previene la autocatálisis
2) Necesitan de proteínas adaptadoras y cofactores
que cambien su conformación y las vuelvan activas
3) Compartimentalización de caspasas y cofactores
Niveles de regulación de caspasas
4) Unión específica de inhibidores naturales:
FLIP
IAPs
A diferencia de la familia Bcl-2, IAPs bloquean
tanto la vía mitocondrial como la del R por unión a
caspasas iniciadoras y efectoras
Localización de las caspasas
* Normalmente citosólica
* También se han encontrado en: núcleo
RE
mitocondria
Algunas caspasas pueden traslocarse de un compartimiento celular a otro en presencia de un
estímulo apoptótico
Caspasas 2 y 9: de la mitocondria al citosol
Caspasa 7: del citosol a la mitocondria
Las dos vías de muerte y sus inhibidores
naturales
Miembros de la familia IAP
Para oponerse a la destrucción celular mediada por
caspasas se cuenta con dos clases de inhibidores
* Miembros de la familia Bcl-2: bloquean la vía mitocondrial
* Miembros de la familia IAP: bloquean la vía mitocondrial y la vía del receptor
Se unen a caspasas iniciadoras y efectoras e inhiben
su actividad
Miembros de la familia IAP
NIAP:atrofia
muscular espinal
BIR: Cys/His
RING, UBC:
ubiquitin
ligasa
Degradación de
caspasas unidas
vía proteasoma
Inhibición de caspasas por IAPs
XIAP
Es el más potente inhibidor de caspasas 3, 7 y 9
Aún no se conoce la función del dominio BIR 1
La región que circunda BIR 2 une específicamente
caspasas 3 y 7
BIR 3 une caspasa 9
BIR 2 no tiene rol directo en la inhibición de caspasas
XIAP es una proteína modular
BIR3 de XIAP se une
a la caspasa 9
clivada
BIR 3 reconoce un tetrapéptido Ala-Thr-Pro-Phe
Este tetrapéptido
también se encuentra
en SMAC/DIABLO
La caspasa 3 cliva a la procaspasa 9
Posibles funciones de BIR 1
* Puede actuar estabilizando XIAP
* Puede interactuar e inhibir caspasas aún no
identificadas
* Puede proveer una interfase para la unión de
proteínas que interactúan con XIAP, modificando
su actividad
¿Porqué tener una proteína con diferentes
dominios que inhiban distintas caspasas?
Permite la regulación simultánea de varias caspasas
XIAP se une al apoptosoma donde interactúa con
caspasas 9 y 3 sugiriendo que previene:
* la activación de caspasa 3 por caspasa 9
* la liberación de la caspasa 3 del apoptosoma
XIAP se asocia con el apoptosoma
La proximidad de
XIAP a caspasas 3
y 9 y el hecho de que
distintos dominios
inhiban caspasas 3 y 9
justificarían la alta
eficiencia y potente
inhibición de estas
caspasas por XIAP
Inhibiendo a los inhibidores
SMAC/DIABLO
Second Mitochondria derived Activator of Caspase
Conecta a los IAPs con la MC controlada por la M
Se sintetiza como un precursor que se trasloca a la
mitocondria
Allí se remueve un N-term de 55 aácidos (sec. de
targeting) y se expone un tetrapéptido Ala-Val-Pro-Ile
esencial para su unión a IAPs
Interactúa con: XIAP, c-IAP ½ y survivina
Activación de caspasas por SMAC/DIABLO
El linker
NH2-t de
BIR2 ocupa
el sitio de
unión del
sustrato de
caspasas
XAF1: una proteína de interacción con XIAP
XIAP- Asociator Factor I
Antagoniza la habilidad de XIAP para inhibir la
actividad de caspasas “in vitro”
A diferencia de SMAC/DIABLO no necesita ser
procesado
Está localizado en el núcleo y no se conoce el
mecanismo de inhibición. Se propone que
ocurre en el núcleo
Los dos mecanismos posibles de regulación de XIAP
Smac/Diablo:
No tendría efecto
Sobre la vía del
Receptor
XAF-1: su localización nuclear
sugiere que
puede interceptar
ambas vías
apoptóticas
Miembros de la familia Bcl-2
Proteínas anti-apoptóticas
• BH1-BH4: son indispensables para su actividad de
supervivencia
• BH1-BH4: no tienen actividad catalítica pero intervienen en la interacción con otras proteínas
• BH1-BH3: forman un surco hidrofóbico en la parte
funcional; BH4 interviene en la estabilización del bolsillo hidrofóbico
• Si se remueve BH4 la proteína se transforma en proapoptótica
Miembros pro-apoptóticos
* Ante un estímulo apoptótico exponen su dominio BH3
mediante un cambio conformacional (Bcl-2 no puede
hacerlo)
* Este dominio BH3 es el que va a interaccionar con el
bolsillo hidrofóbico de las proteínas anti-apoptóticas
* El cambio conformacional puede ocurrir por:
defosforilación: Bad
clivaje: Bid
* La consecuencia del cambio conformacional es
la traslocación a la mitocondria
Bax: targeting, inserción, oligomerización y
formación del canal
No hay
canal
canal
Modo de acción de Bcl-2-like y
Bax-like factors
El casposoma de C.Elegans
Modo de acción de una proteína BH3-only
BH3-only
Sensores y
Mediadores
de las respuestas
apoptóticas
Targeting de Bid y Bad a la mitocondria
(A): t-Bid se puede
unir a Bax o Bcl-Xl
(B): independiente
de caspasas
(C): un aumento en
la conc. de Ca++
induce la calcineurina
fosfatasa
que defosforila Bad
Traslocación de proteínas en la apoptosis
Traslocación de proteínas durante la apoptosis
Fases en la decisión de la muerte celular
Cambios mitocondriales durante
la apoptosis
Mecanismos de liberación de
Citocromo c
Redistribución celular de la mitocondria
Cambios morfológicos
a) Teñido de la mitocondria normal
b) Mitoc. transfectadas con Bax e inhibidor general de caspasas:
la mitocondria se condensa
c) La mitocondria forma clusters alrededor del núcleo
Mecanismos de liberación de citocromo c
Se han postulado dos teorías:
1) Teoría de la ruptura no específica de la MME
PTP
2) Teoría de formación de canales conductores de
citocromo c
Posibles componentes del PTP
Canal no selectivo
BPR: receptor
benzodiazepinas
CK: creatina
quinasa
HK: hexoquinasa
Cph. D:
ciclofilina D
La apertura del PTP puede dispararse por efectores
fisiológicos como iones Ca, ROS, variaciones de pH,
Bax
Consecuencia: repentino incremento de la permeabilidad
de MMI ( 1,5 kDa), disipación del potencial dependiente de protones y desequilibrio químico entre citoplasma
y matriz mitocondrial
Estos eventos causarían un swelling de la matriz debido
a su alta concentración de solutos conduciendo a la
disrupción de la MME
La ruptura de la MME ha sido raramente descripta y no
explicaría la salida de proteínas del espacio
intermembrana
Formación de canales conductores de cit. c
• Las estructuras de Bcl-XL y Bid se asemejan a las de
algunas toxinas que pueden formar canales para iones
y proteínas
• Bcl-XL, Bcl-2, Bax y tBid forman canales funcionales
en vesículas sintéticas
• Las propiedades intrínsecas de los canales formados
por proteínas pro y anti-apoptóticas difieren significativamente. Esto explicaría sus influencias opuestas sobre la liberación de citocromo c
Liberación del Cyt c de la mitocondria
c) Bax se oligomeriza y forma megacanales
d) Bax coopera con VDAC para formar un gran canal
e) Bax o tBid forman un poro lipídico o un complejo proteínalípido
Otras moléculas involucradas en al apoptosis
Traslocación de proteínas durante la apoptosis
Descargar

ESTRUCTURA DEL APOPTOSOMA