Métodos de cultivo
Importancia del cultivo de
microorganismos:
• Obtención de cultivos puros.
• Análisis morfológico, fisiológico, genético y
otras características.
• Producción.
• Conteo de
colonias (UFC)
¿Qué condiciones requiere el crecimiento microbiano?
medio de cultivo: Una solución acuosa con los nutrientes y factores
de crecimiento necesarios.
Los μorganismos crecen en un
medio de cultivo artificial se
requieren condiciones como:
temperatura,
grado de humedad y
presión de oxígeno
así como un grado correcto
de acidez o alcalinidad
.
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Según su estado físico
Líquidos
Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes
disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado
número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo.
Sólidos
Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les
añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se
utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los
microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.
Según la naturaleza de sus constituyentes
Medios naturales o complejos
Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o
vegetal
usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras
sustancias.
No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni
las cantidades exactas en que están presentes. Ej. Extracto de
carne, extracto de levaduras.
Medios sintéticos o definido
Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo
tanto,
Se puede conocer exactamente su composición cuali y cuantitativa.
Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales.
E. coli
Medio definido
Medio Complejo
K2HPO4
7g
Glucosa
15 g
KH2PO4
2g
Extracto de levadura
5g
(NH4)2SO4
1g
Peptona
5g
MgSO4
0.1 g
K2HPO4
2g
CaCl2
0.02 g
Agua destilada
1000 ml
Glucosa
4-10 g
pH
7
Elementos traza (Fe, Co,
Mn, Zn, Cu, Ni, Mo)
2-10 µg
Agua destilada
1000 ml
pH
7
3. Según sus propósitos de uso
Medios de enriquecimiento
Al cultivo en medio líquido que resulte en un incremento
en el número de un tipo dado de μorganismo en relación
con el número de otros tipos de μorganismos que
puedan estar en el inóculo.
Puede contener sustancias que favorezcan el
crecimiento del μorganismo que nos interesa o que
inhiban el crecimiento de otro tipo de microorganismos
presentes.
La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está
determinada únicamente por la composición química,
sino que puede ser variada significativamente
modificando otros factores tales como: temperatura, pH,
fuerza iónica, iluminación, aireación etc.
Ej. Caldo tetrationato y selenito. utilizado para el
enriquecimiento de las especies del género Salmonella
provenientes de muestras de heces, orina, agua o
alimentos.
Agua de peptona alcalina (Vibrio cholerae)
Adición de sangre, suero o extracto de tejidos de animales y
plantas.
Medios selectivos
Se diferencian de los enriquecidos por ser medios
sólidos y están diseñados para el aislamiento de
microorganismos específicos.
Ej. CO2 como fuente de carbono es selectivo para
autótrofos, la adición de cristal violeta se inhibe el
crecimiento de los Gram+, utilizando maltosa como
única fuente solo crecerán los que usen maltosa.
(Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)
Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis,
Sacarosa (TCBS): Vibrio
• Agar Cetrimida: Pseudomonas
Medios diferenciales
Son aquellos destinados a facilitar la
discriminación de microorganismos de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de
crecimiento en dichos medios.
contienen indicadores de productos derivados
de la actividad metabólica de los μorganismos
sobre algunos de los componentes del medio.
Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar
fermentación de carbohidratos
. Agar Eosina Azul de Metileno:
coliformes y E. coli
Medio de cultivo
Tipo de medio
Agente bacteriostático
Azúcar fermentable
Sistema Indicador
ALRF (agar lactosa rojo
fenol)
diferencial (no selectivo) -----
lactosa
rojo fenol
Agar Cetrimide
selectivo
bromuro de cetiltrimetil
amonio
-------
--------
Agar Mac Conkey
selectivo y diferencial
cristal violeta, sales
biliares
lactosa
rojo neutro
SS agar (Salmonella
Shigella)
selectivo y diferencial
verde brillante, sales
biliares
lactosa
rojo neutro, citrato férrico
VRBA (violeta rojo bilis
agar)
selectivo y diferencial
cristal violeta, sales
biliares
lactosa
rojo neutro
Manitol Salt Agar
(Chapman)
selectivo y diferencial
cloruro de sodio
manitol
rojo fenol
EMB agar (eosin methylen
blue)
selectivo y diferencial
eosina y azul de metileno lactosa
eosina y azul de metileno
rojo fenol, citrato férrico
amónico y tiosulfato de
sodio
XLD agar (xilosa lisina
desoxicolato)
selectivo y diferencial
desoxicolato de sodio
BiS agar (bismuto sulfito)
selectivo y diferencial
verde brillante, sulfito de
glucosa
bismuto
indicador de sulfito de Bi
y sulfato ferroso
Baird Parker agar
selectivo y diferencial
Cloruro de litio y telurito
-----de potasio
yema de huevo, telurito de
potasio
TSB + 10% NaCl
enriquecimiento selectivo cloruro de sodio
Caldo Tetrationato
enriquecimiento selectivo Tetrationato, sales biliares ------
CLBVB (caldo lactosa bilis
verde brillante, sales
enriquecimiento selectivo
verde brillante)
biliares
lactosa, xilosa, sacarosa
------
lactosa
-----------producción de gas
Medios de mantenimiento
Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya
que el crecimiento y prolífico suele ocasionar la
muerte rápida de las células.
Ej. Añadir glucosa y utilizarla los microorganismos
producen ácidos, acidificándose el medio por lo
que es preferible no utilizar glucosa en los
medios de mantenimiento
PREPARACIÓN DE MEDIOS
Siempre preparar los medios con agua
destilada (salvo el Marino).
Es necesario ajustar siempre el pH.
Todos los utensilios deben estar perfectamente limpios.
Los medios se preparan en matraces cónicos con tapa.
Se pesa la cantidad de medio requerida, se disuelve o
suspende en el agua.
Se esteriliza a 121°C por 20 min
Se espera a que enfríe (42°C o hasta que se pueda
sostener el recipiente sin quemarse la mano).
• Servir 20 ml Aprox. en cada caja de Petri
Métodos especiales de
cultivo;
•
Siembra en superficie
sobre medio sólido
•
Siembra en profundidad
(vertido en placa)
•
Dilución y solidificación
en tubo
• •
Cultivo en células vivas
•
Cultivo en animales
Mycobacterium leprae
Mantenimiento y preservación de cultivos puros.
-
Resiembra periódica
en medios frescos.
- Preservación de cultivos con
- una capa de aceite mineral.
- Liofilización. Proceso utilizado
para la eliminación de agua,
mediante desecación al vacío y a
muy bajas temperaturas. Con
crioprotectores
leche
descremada 10-20%, suero fetal
bovino, suero equino, mesclas
de suero, glucosa y extracto de
levadura.
inositol,
leche
descremada
Almacenamiento a temperaturas
muy bajas en presencia de
agentes estabilizantes como
glicerol,
dimetilsulfóxido,
glucosa, sacarosa , suero de
conejo, extracto de malta,
nitrógeno líquido, (-196ºC)
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