Marcadores moleculares y su
aplicación a la biomedicina
Cátedra de Biología Molecular y Genética - 2012
Cariotipo Humano
La dotación cromosómica humana está compuesta por 22 pares de
autosomas y el par de cromosomas sexuales
Alelo y Mutación
 El concepto molecular de
alelo es: cualquier alternativa
en la información genética
contenida en un locus
determinado. En un
organismo diploide cuando se
presentan alelos idénticos es
Homocigoto, si son diferentes
es Heterocigoto.
 Molecularmente una
mutación se entiende como
cualquier cambio que
modifica la secuencia de bases
de un gen. En un sentido
genéticamente funcional
mutación es el cambio de un
gen en su alelo.
Marcadores Moleculares
 Cuando la variantes en el genoma se presenta en la población con
una frecuencia mayor al 1% se denominan polimorfismos.
 Los
cambios fenotípicos heredables
marcadores morfológicos.
significativos
son
 La variación de un solo nucleótido de ADN es un marcador
molecular.
 Los marcadores moleculares se pueden definir como
cualquier segmento específico del genoma que varían entre
diferentes genotipos, pudiendo en algunos casos relacionarlos
con un rasgo genético (Spooner et al., 2005).
Estructura de un gen
Biomedicina: Punto de partida para el estudio
molecular de muestras.
Un ejemplo de aplicación
EJEMPLOS DE TÉCNICAS DE
DETECCIÓN DE POLIMORFISMO
PCR, ARMS, RFLP, SSCP-HD Y SECUENCIACIÓN.
Polimorfismos
¿QUÉ TIPOS DE VARIANTES ALÉTICAS CONOCE?
¿QUÉ TIPOS DE SOPORTE DE CORRIDA ELECTROFORÉTICA
CONOCIÓ EN ESTA MATERIA?
En la PCR se
realizan de
20-40 ciclos
REACTIVOS PARA AMPLIFICAR
TSER
La proteína de este gen es el blanco terapeútico del quimioterápico 5fluorouracilo, el cual se utiliza en el tratamiento de algunos tumores
epiteliales.
Esquema de la estructura de la región 5`-UTR TYMS con las tres
repeticiones de la secuencia
Un mayor número de repeticiones indicaría un aumenta la expresión
proteica.
Al menos un conjunto de estas repeticiones y su secuencia
complementaria es necesario para una eficiente expresión y los
posibles mecanismos para mejorar el efecto de la repetición podrían
ser un factor desconocido nuclear que se une a la región, o la
formación de tallo en los bucles de la región 5`-terminal del mRNA
de TYMS.
Polimorfismo de TYMS
2R
3R
4R
5R
299 pb
271 pb
243 pb
215 pb
PM S1
350 pb
222 pb
C-
Gel de poliacrilamida
amplificaron fragmentos a
dos muestras y en la
también, se observa a 271
al 10%, se
243 pb en las
muestra S1,
pb.
MÉTODOS DE ESTUDIO DE SNPs
 RFLP-PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA –
POLIMORFISMOS EN LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE
RESTRICCIÓN).
 ARMS-PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA –
SISTEMAS DE AMPLIFICACIÓN DE MUTACIONES REFRACTARIAS).
 ASO-PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA –
OLIGONUCLEÓTIDOS ESPECÍFICOS DE ALELO).
RFLP-PCR
PCR
Digestión enzimática
Ejemplo de RFLP
ARMS - PCR
Variante de ARMS
Gen CFTR: determinante de fibrosis quística
Fibrosis quística: Gen CFTR
Los síntomas clínicos dependen de:
Mutación
Presencia de ambos alelos mutados.
Coexistencia de dos mutaciones en el mismo alelo: “alelos complejos”.
Detección de polimorfismos:
PCR-ARMS: la mutación más frecuente deltaF508, es la primera que se
determina para confirmar el diagnóstico.
SSCP –Heterodúplex: es una técnica que permite detectar en un fragmento de
PCR uno o más polimorfismos.
Clases de mutaciones en el gen CFTR:
I Bloquean la síntesis de la proteína
II Afectan el procesamiento postraduccional. Ejemplo deltaF508.
III Afectan la regulación del canal de cloro. Ejemplo G551D.
IV Conductancia del canal de cloro.
V Reduccion en la síntesis de la proteína.
Esquema representativo
POLIMORFISMOS EN LA
CONFORMACIÓN DE LA
CADENA SIMPLEHETERODÚPLEX (SSCPHD)
Ejemplos con SSCP-HD
MTHFR PAGE minigel
induced heteroduplexes.
showing
Factor V Leiden PAGE
minigel showing induced
heteroduplexes.
Prothrombin PAGE minigel
induced heteroduplexes.
showing
Gel de poliacrilamida con un fragmento
amplificado (teñido con nitrato de plata).
Ejemplos con
SSCP-Heterodúplex
MTHFR PAGE minigel
induced heteroduplexes.
Factor V Leiden PAGE
minigel showing induced
heteroduplexes.
Prothrombin PAGE minigel
induced heteroduplexes.
showing
showing
SSCP-HD de los polimorfismos C749T y G846A de SSTR2
1s 2s 1d 2d 3s 3d 4s 4d 5s 5d 6s 6d 7s 7d 8s 8d 9s 9d M1s d M2s d M5s
Gel de poliacrilamida al 10%, se observan los fragmentos amplificados que contienen los SNPs 749 y 846 de
SSTR2. En los carriles 1 y 2, y los impares del 5 al 17 se observan las cadenas simples los individuos con
cáncer de mama: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8. Los últimos 5 carriles contienen los controles.
Secuencia amplicada que contiene los
polimorfismos del promotor del gen SSTR2.
PARA OBTENER LAS
SECUENCIAS
NUCLEOTÍDICAS A
PARTIR DE UN
AMPLICÓN DE UNA
MUESTRA TENEMOS
QUE SECUENCIAR.
Secuenciación de amplicones seleccionados
Alineamiento con el programa ClustalX
Si conocemos los polimorfismos o
mutaciones que están relacionados
con la enfermedad y el paciente no
posee ninguno de ellos ¿Cómo
podemos saber se hay otros cambios
del mismo que afectan a la
enfermedad? Y ¿Cómo hacemos
para estudiarlas?
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Punto de partida para el estudio de Muestras