Tesis de Grado I
Estudio de la producción de
azucares fermentables a partir de la
celulosa contenida en desechos
agrícolas o industriales, a partir de
una hidrólisis enzimática.
Tutor Académico:
Prof Rafael Martín Belmonte
Elaborado por:
Daniela Narciso
Tesis de Grado I
Planteamiento
del Problema
Introducción
Tesis de Grado I
Antecedentes
Antecedentes
• Charles Wilke y Gautam Mitra (1974), patentaron el
proceso para la conversión de materiales celulósicos por
medio de una degradación enzimática.
• Folke Tjerneld e Ingrid Persson (2004), estudiaron las
particiones de la Trichoderma reesei con el objeto de
diseñar un sistema de fases.
• Okazaki y Moon-Young (2005) desarrollaron un modelo
matemático de la cinética de la reacción enzimática,
basándose en el modelo de Michaelis-Menten.
Tesis de Grado I
Objetivos
Objetivo General
Estudiar
enzimática
residuos
el
proceso
del
bagazo
agrícolas
de
de
de
hidrólisis
caña
o
composición
similar para la producción de azúcares
fermentables.
Objetivos Específicos
• Determinar las ventajas de la realización de un
pretratamiento del sustrato antes de la realización
del proceso de hidrólisis.
• Comparar el comportamiento de los diferentes
sustratos
en
fermentables.
la
producción
de
los
azúcares
Objetivos Específicos
• Determinar las condiciones de operación óptimas para
cada uno de los sustratos en lo que se refiere a la
concentración de enzimas, concentración de sustrato y
tamaño de partícula de sustrato.
• Determinar las características principales del reactor
que llevará a cabo dicho proceso a escala industrial.
• Establecer las diferencias básicas entre la hidrólisis
ácida y la hidrólisis enzimática.
Tesis de Grado I
Marco
Teórico
Biomasa
Se denomina biomasa al grupo de productos
energéticos y materias primas de tipo renovable que
se originan a partir de la materia orgánica formada
por vía biológica.
Fuentes de Biomasa
Valor Energético de la Biomasa
Características de la Biomasa
• Amigable con el medio ambiente ya que su balance de
emisiones de CO2 es cero.
• Es una fuente de energía renovable.
• Permite reactivar la economía de zonas rurales y de países
sin hidrocarburos.
• Generación de gran cantidad de empleos.
• Aprovechamiento de recursos que antes eran en su mayoría
desechados.
• Está conformada por Lignina, Hemicelulosa y Celulosa.
Lignina
Es un polímero tridimensional que se forma a partir de
las unidades fenilpropánicas que se han desarrollado, de
manera aleatoria, formando una molécula grande y
compleja con muchas clases diferentes de ligamentos
entre los bloques estructurales.
Por ser un compuesto de difícil degradación, representa
el principal obstáculo del proceso de hidrólisis.
Lignina
Hemicelulosa
La hemicelulosa es un polímero de cadena más corta y
ramificada cuyos monómeros pueden ser de cinco
átomos de carbono, o de seis átomos de carbono. Son
de naturaleza amorfa y sirven, con la lignina, para formar
la matriz en la cual se incrustan las fibrillas de celulosa.
Celulosa
La celulosa es un polisacárido lineal formado por
residuos de glucosa unidos por enlaces b 1-4.
Éstas cadenas lineales de celulosa interaccionan entre si
por medio de enlaces de puentes de hidrógeno dando
lugar a la formación de microfibrillas.
Bagazo de Caña
El bagazo es el residuo del tallo o cuerpo de la caña de
azúcar que queda después de que se le ha extraído el
jugo, ya sea en el ingenio o en el trapiche.
Entre los usos del bagazo tenemos:
• Producción de biocombustibles.
• Abono.
• Combustible en el ingenio.
• Otros.
Composición del Bagazo de Caña
Componentes
(%)
Humedad
50
Fibra
46
Brix
2
Impurezas Minerales
2
Componentes
(%)
Celulosa
50
Hemicelulosa
25
Lignina
25
Ventajas del Uso del Bagazo de Caña
• Elevada
eficiencia
fotosintética,
es
decir,
puede
sintetizar carbohidratos solubles a una tasa superior al
de otros cultivos comerciales.
• Es un cultivo permanente.
• La duración de la cepa es de 5 cosechas.
• La energía
invertida en la producción de caña
representa, a lo sumo, el 5% de su potencial.
Enzimas
Las enzimas, también conocidas como biocatalizadores,
son aquellos compuestos proteínicos que actúan como
catalizadores de numerosas reacciones biológicas.
Estas no modifican el sentido de los equilibrios
químicos, sino que aumentan la velocidad de la
reacción.
Características de las Enzimas
• Son efectivas en pequeñas cantidades.
• No
sufren
modificaciones
químicas
irreversibles
durante la catálisis.
• Pueden catalizar procesos a bajas temperaturas
• No afectan la condición de equilibrio de la reacción
que catalizan.
Clasificación de las Enzimas
Grupo
Acción
Oxidoreductasas Catalizan reacciones de oxidorreducción.
Transferasas
Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura
de ciertas moléculas) a otras sustancias receptoras.
Hidrolasas
Actúan en reacciones de hidrólisis con la
consiguiente obtención de monómeros a partir de
polímeros.
Isomerasas
Actúan sobre determinadas moléculas obteniendo de
ellas sus isómeros de función o de posición.
Liasas
Realizan la degradación o síntesis de los enlaces
denominados fuertes sin ir acoplados a sustancias de
alto valor energético.
Ligasas
Realizan la degradación o síntesis de los enlaces
fuertes mediante el acoplamiento a sustancias ricas
en energía como los nucleosidos del ATP.
Cinética Enzimática
La cinética enzimática estudia la velocidad de las
reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios
proporcionan información directa acerca del mecanismo
de la reacción catalítica y de la especificidad de la
enzima.
En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron
la teoría de la cinética enzimática y propusieron una
ecuación de velocidad que explica el comportamiento
cinético de las enzimas.
Ecuación de Michaelis-Menten
Michaelis y Menten propusieron que las reacciones
catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas.
Celulasa
Son
biocatalizadores
de
naturaleza
proteica,
que
participan en el rompimiento de los enlaces glicosídicos
b-1,4 presentes en los polisacáridos celulosa, liberando
al medio glucosa y otros monosacáridos.
endo-b-glucanasas
exo-b-glucanasas
b-glucosidasa
Mecanismo de Acción de la Celulasa
Microorganismos Productores de Celulasa
Microorganismo
Tipo de Respiración
Bacterias
Cellulomonas
Aeróbico
Pseudomonas Fluorescens
Aeróbico
Clostridium
Thermocellulaseum
Anaeróbico
Hongos
Aspergillus Níger
Aeróbico
Fusarium Solani
Aeróbico
Trichoderma Reesei
Aeróbico
Trichoderma Viride
Aeróbico
Aspergillus Niger
Pretratamientos
Los pretratamientos son requeridos para alterar la
estructura de la biomasa para hacerla mas accesible a
las enzimas que convertirán a las cadenas poliméricas
en azúcares fermentables.
La meta es romper el sello que forma la lignina y la
hemicelulosa e irrumpir en la estructura cristalina de la
celulosa.
Pretratamientos
Lignina
Celulosa
Pretratamiento
Hemicelulosa
Objetivos de los Pretratamientos
• Reducir la cristalinidad de la celulosa.
• Disociar el complejo lignina-celulosa.
• Aumentar el área superficial de la fibra de celulosa.
• Disminuir la presencia de aquellas sustancias que
dificulten el proceso de hidrólisis.
Características de los Pretratamientos
• Deben ser muy eficaces.
• Bajos costos de inversión y mantenimiento.
• Bajo consumo energético.
• Utilización de reactivos económicos.
• Posible aplicación a diversos sustratos.
Tipos de Pretratamientos
Pretratamiento Químico
Ozonólisis
Hidrólisis con Ácido Diluido
Hidrólisis con Ácido Concentrado
Hidrólisis Alcalina
Deslignificación Oxidativa
Organosolventes
Tipos de Pretratamientos
Pretratamiento Físico
Pulverizado Mecánico
Pirólisis
Pretratamiento Físico-Químico
Explosión con Vapor
Agua Líquida Caliente (LHWP)
Explosión de fibra con Amoníaco
Pretratamiento Biológico
Pretratamiento con Hongos
Hidrólisis
La hidrólisis de residuos lignocelulósicos tienen como
finalidad la transformación de los polisacáridos que estos
contienen en azúcares sencillos, fermentables a su vez a
distintos productos de interés industrial.
La hidrólisis se puede llevar a cabo tanto por vía química
como por vía biológica.
Hidrólisis Química
Este proceso utiliza ácidos como H2SO4, HCL y HF a
diferentes concentraciones, altas temperaturas y en
diversos procesos operativos.
Hidrólisis Enzimática
La hidrólisis enzimática de la celulosa consiste en la
utilización de enzimas celulolíticas, producidas por
algunos hongos y bacterias, para obtener una solución
de
glucosa
a
partir
originalmente insoluble.
de
dicho
sustrato
que
es
Ventajas y Desventajas de la Hidrólisis Enzimática
Ventajas
Desventajas
Opera a condiciones suaves de La lentitud del proceso debido a
temperatura (30 – 50 °C)
la
propia
estructura
de
los
sustratos celulósicos nativos.
La no utilización de agentes
químicos, ya que así se evita la
corrosión de los equipos y la
degradación
de
los
azúcares
producidos.
Alta especificidad.
La necesidad de recuperación de
las
enzimas
reacción.
del
medio
de
Tesis de Grado I
Metodología
Laboratorio
Materiales
Complejo Enzimático
(Celulasa)
Bagazo de Caña
Reactivos
Solución
Ácido
Solución de Glucosa
Amortiguadora
Dinitrosalicílico
de 40 mMol
Acetato
Equipos
Baño
Termostatizado
Equipos
Molino con tamiz
incorporado
pH metro
Equipos
Plancha de Calentamiento y Agitación Magnética
Espectrofotómetro
Equipos
Balanza Analítica
Balanza Galénica
Método DNS
El seguimiento de la hidrólisis se realizará por medio de
la determinación del contenido de azucares fermentables
solubles por medio del método del ácido dinitrosalicílico.
El acido dinitrosalicílico se reduce formando el acido
3-amino-5-nitrosalicílico, mientras que el grupo aldehído
reductor se oxida para formar un grupo carboxílico, lo
cual causa diferencias de coloración que pueden
determinarse por espectrofotometría, a una longitud de
onda de 570 nm.
Método DNS
•
Se toma 0.4 ml de la solución azucarada y se coloca en
un tubo de ensayo.
•
Añadir 4 ml de la solución de DNS agitando para
homogenizar.
•
Calentar la muestra en un baño de agua a ebullición
durante 10 minutos.
•
Enfriar la solución a la temperatura ambiente en un
baño de agua fría.
•
Medir la absorbancia en un espectrofotómetro a 570
nm.
Método DNS
Curva de Calibración de Glucosa
• Preparar soluciones con concentraciones conocidas de
glucosa.
• Aplicar el método del DNS.
• Enfriar las muestras a la temperatura ambiente.
• Calibrar el espectrofotómetro a cero con el blanco.
• Determinar la absorbancia a 570 nm.
• Construir la curva de calibración de glucosa graficando a la
absorbancia obtenida en función de la concentración de
glucosa.
Acondicionamiento de la Materia Prima
• Colocar al bagazo de caña en una estufa a 76 °C
durante 24 h.
• Moler el bagazo de Caña.
• Pasar el bagazo molido a través de tamices.
• Clasificar el bagazo según su tamaño de partícula.
• Almacenar el bagazo en frascos de vidrio dentro de
bolsas
de
ambiente.
plástico
herméticas
a
temperatura
Pretratamiento LHWP
La porción de
bagazo de caña a ser pretratado se
coloca en una olla de presión con 2 litros de agua por 1
hora a 2 atm de presión.
Hidrólisis Enzimática
Valores Óptimos de las Variables de Operación
Temperatura (°C)
37
pH
5,0
Hidrólisis Enzimática
• Preparar soluciones de celulasa en buffer acetato a
pH = 5 y a las diferentes concentraciones de estudio.
• Pesar la masa de sustrato y sumergirlo en la solución
de celulasa en buffer. La proporción dependerá de la
relación líquido – sólido que se pretende estudiar.
• Incubar la solución en un baño termostatizado a 37 °C
con agitación suave.
• Aplicar el método del DNS a la solución en ciertos
intervalos de tiempo.
Estrategia de Análisis
Concentración
Masa de
de enzima
Sustrato
0,25 g
0,5 g
2g
1,5 g/l
3 g/l
6 g/l
Estrategia de Análisis
Adicionalmente, se realizara pruebas para:
• Diferentes tamaños de partícula.
• Bagazo sin pretratamiento.
• Otros sustratos.
Hidrólisis Química
• En un erlenmeyer colocar la muestra de bagazo de
caña en contacto con una solución de H2SO4 al 4% y
a una relación liquido/sólido de 30/1.
• Colocar el recipiente en un baño termostatizado y
fijar la temperatura de reacción en 100 °C.
• Agitar la mezcla de reacción con un agitador
magnético.
Hidrólisis Química
• Cada cierto tiempo se toman muestras de la solución
y se le aplica un enfriamiento brusco y se filtra a
través de papel de filtro whatman No 1 para detener
la hidrólisis.
• Añadir a la solución NaOH 2 M hasta lograr un pH de
4,5.
• Aplicar el método del DNS.
Resumen de la Metodología
Tesis de Grado I
PREGUNTAS
Tesis de Grado I
GRACIAS
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