Cromatografía de líquidos
de alta resolución
HPLC
1
Qué es Cromatografía Líquida de
Alta Eficiencia?
► La
cromatografía de líquidos de alta
resolución,
es
un
modo
de
cromatografía en la cual el proceso de
separación y transferencia de masa es
entre la fase estacionaria y la fase
móvil y una temperatura dada.
2
► La
HPLC, representa una de las herramientas
más empleadas en el laboratorio analítico
moderno.
► La
cromatografía es un método, usado
primariamente para la separación de los
componentes de una muestra, en la cual los
componentes se distribuyen en dos fases.
3
Diferencias. Fase Móvil
► Si
es un gas: Modalidad cromatográfica gaseosa.
► Si es un líquido: Cromatografía líquida.
►Cromatografía
en capa delgada.
►Cromatografía líquida en columna abierta.
►HPLC.
4
Diferencias
HPLC y GC: Tipo de detectores y la influencia de la
fase móvil.
► GC: se utiliza para separar mezclas que contienen
compuestos orgánicos volátiles.
► En GC es muy simple encontrar detectores que
diferencien la muestra de la fase móvil.
► En HPLC es más difícil ya que la fase móvil no sólo no
es inerte sino que su masa es sensiblemente superior.
►
5
Clasificación de la
Cromatografía de Líquidos
► Cromatografía
Líquido-Sólido.(adsorción)
► Cromatografía Líquido-Líquido.(partición)
► Cromatografía de Fase (normal y reversa)
► Cromatografía de Intercambio iónico.
► Cromatografía de Exclusión por Tamaño
(cromatografía en gel)
6
Fase Estacionaria
► Si
la fase estacionaria es un sólido y la fase
móvil un líquido la Cromatografía se denomina
CLS.
► Análogamente existirán una cromatografía CLL,
CGL y CG.
► Así, la Cromatografía puede clasificarse en
modalidades de afinidad y por tamaño
molecular.
7
Clasificación por Afinidad
► Cromatografía
en fase normal.
► Cromatografía
en fase ligada.
► Cromatografía
de intercambio iónico.
8
De Fase Ligada
► Reemplazando
el tipo común de unión de la fase
estacionaria a su soporte, haciéndola perdurable
por medio de una unión química covalente.
► Ahora las separaciones se efectúan sobre
material químicamente modificado, con un
amplio rango de polaridad y selectividad.
9
Intercambio iónico
►Se
emplean rellenos en los cuales
la partícula está constituida por un
polímero o por sílica gel, en cada
caso unida a un grupo funcional
aniónico o catiónico.
10
Exclusión por Tamaño
► Emplea
materiales de porosidad controlada, que
funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las
moléculas de la muestra según un orden
decreciente de tamaño molecular.
► Si
se dispone de estándares apropiados, de peso
molecular adecuado, puede evaluarse el PM de
un compuesto desconocido.
11
Equipos
12
Clasificación de Equipos
►
Integrados: Cada una de sus partes están reunidas en un
gabinete y su intercambio o conexión con otros
componentes es difícil.
►
Modulares: Los módulos son instrumentos individuales
que permiten no solo armar el equipo según las
necesidades, sino aumentar su complejidad según esa
necesidad varíe.
13
Componentes principales
►
►
►
►
►
►
Solvente
Bomba de alta presión
Inyector
Columna
Detector
Graficador
14
Partes del cromatógrafo
En el caso más simple, el cromatógrafo líquido está
constituido por:
Un reservorio de solvente que alimenta al sistema con la fase
móvil.
Un sistema para forzar el pasaje de la muestra por la columna:
Bomba.
Un sistema que permite la introducción de la muestra: Inyector.
Un sistema de monitoreo de la solución que emerge de la
columna: Detector.
Un sistema de registro de los datos proveniente del detector.

15
Diagrama Básico de un sistema
de HPLC
16
Esquema
17
18
Bases de la separación
► Cuando
la fase móvil y la muestra son forzadas a
atravesar la fase estacionaria, se presentan
diferentes tipos de interacciones: hidrofóbicas,
puentes de Hidrógeno, interacciones dipolares y
electrostáticas, éstas son responsables de la
mayor o menor afinidad de cada uno de los
componentes de la muestra por alguna de las
fases.
19
Separación
20
Figura, 41 Explicar
21
►
La eficiencia de una columna cromatográfica y,
por lo tanto, su poder separativo se mide en
función de su número de platos teóricos.
►
Para lograr la separación de dos componentes
dados, no sólo deben eluir a distintos tiempos de
retención, sino que el ancho de los picos debe ser
tan bajo como sea posible.
22
► Aspectos
técnicos
23
Qué es Cromatografía Líquida
de Alta Eficiencia?
HPLC utiliza una fase móvil líquida para
separar los componentes de la mezcla. El
solvente trabaja a una presión de 6,000 psig
► Los componentes o analitos deben ser
disueltos en un solvente y se pasan por la
columna cromatográfica a altas presiones.
► La resolución depende de la interacción entre
el soluto , los componentes y la fase
estacionaria.
►
24
Elección del Solvente
Características:
► Disponible comercialmente
► Precio
► Pureza y Estabilidad. En la
actualidad
contamos con productos de calidad de pureza
cromatográfica. Bajo contenido de impurezas.
► Disolver la muestra
► Miscible con otros solventes para formar
mezclas útiles
25
Eleccción del Solvente
Características:
► No degradar o disolver la fase estacionaria
► Tener baja viscosidad para reducir las caídas
de presión
► Ser compatible con el detector utilizado.
Transparencia óptica (cuando se usan
detectores UV)
► Se prefieren solventes de punto de ebullición
intermedio.
26
Tipos de solvente
Name
MW
BP
I.R.
[°C]
UV
Viscosidad
µ
[nm]
[cP]
[Debye
]
Acetonitrile
41
82
1.341
195
.358
3.37
Dioxane
88
101
1.421
215
1.26
0.45
Ethanol
46
78
1.359
205
1.19
1.68
Methanol
32
65
1.326
205
.584
1.66
Isopropanol
60
82
1.375
205
2.39
1.68
Tetrahydrofuran
72
66
1.404
215
2.20
1.70
Water
18
100
1.333
185
1.00
1.84
27
Filtración y Desgasificación de
solventes
► Las
partículas
pueden
ocasionar
costosos daños a la bomba HPLC, al
guarda columnas, y en general causar
desgaste del sistema de HPLC. Los
fabricantes de los instrumentos tienen
en cuenta este problema y recomiendan
que se filtre ( 0.45 o 0.22 micras) y
desgasifique los solventes HPLC antes
de usarlos.
28
Filtración y Desgasificación de
solventes
► El
Oxígeno Disuelto puede producir mayor
interferencia
en
los
detectores
de
fluorescencia y electroquímicos.
► El Nitrógeno Disuelto es el otro componente
de la atmósfera que puede producir burbujas
en la columna de HPLC y cuando el solvente
entra al detector produce picos falsos y
desviaciones de la línea base.
► El Dióxido de Carbono disuelto algunas
veces puede ser la causa de los cambios de
pH en el sistema de solvente
29
Métodos de Filtración de
Solventes en HPLC
►Hay
tres(3) métodos comunes que
se utilizan hoy para la filtración
previa de los Solventes en HPLC :
►Filtro
a la Entrada del Solvente
►Filtración al Vacío
►Filtración en Línea
30
Métodos de Desgasificación de
Solventes en HPLC
► Existen
cuatro métodos comunes usados
para desgasificar solventes en HPLC previos a
su uso:
► Sonificación
► Burbujear
Helio
► Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo
► Desgasificación al Vacío en Línea
► Temperatura
31
Preparación de fase móvil
► Ajuste
de pH, parámetro critico en la retención de
solutos ionizables ( medir antes de dosificar
modificador orgánico)
► El pH de la solución aumenta con la
incorporación de un modificador orgánico.
► A valores pH mayores de 7.5 disolución de sílice (
sangrado)
► A pH menor a 2 se hidroliza la unión entre la sílice
y la fase enlazada.
32
Bombas
Requisitos o aspectos más importantes
que debe reunir una bomba o sistema
de bombeo:
► Debe producir presiones estables hasta
6000 psi.
► Mantener el flujo libre de pulsaciones
► Generar intervalos de caudales de flujo
(0,1 a 10 ml/min).
33
Bombas
► Control
y reproducibilidad del flujo de
solvente
► Componentes de la bomba resistentes a
la corrosión
34
Bombas
► Las
bombas que se usan en HPLC se
pueden clasificar según su
funcionamiento y diseño en:
► Mecánicas
 Recíprocantes
 De desplazamiento contínuo
► Neumáticas
35
Bombas
Principio de la bomba reciprocante
36
Bomba w 600
► Velocidad
de flujo (0.01 a 0.5 ml/min, 0.1 y
mayores con presión de 0 hasta 6000 psi
► Exactitud de flujo 0.5 % +/- 1.0 %
► Precisión +/- 0.1 % a 0.3 %
► Ruido : pulsaciones en intervalos de tiempo
► Deriva: cambios en intervalos de tiempo
37
Programación del Solvente
► Existen
dos métodos de programación de Solvente
en HPLC:
 Isocrático
 Gradiente de Elución. Es un término que se
utiliza para describir el proceso mediante el cual
se cambia la composición de la fase móvil.
Pueden efectuarse de dos maneras:
►A
baja presión
►A alta presión
38
39
Sistemas de Inyección de
muestra
► Estos
sistemas han variados durante la
historia del sistema de HPLC, en un
principio de utilizaba la inyección de la
muestra con jeringas de alta presión
cuales ya están de desuso. Hoy se
utiliza el sistema de Válvulas inyectoras
40
Sistemas de Inyección de
muestra
► Generalmente
se usa una válvula
muestreadora con jeringa.
41
► Válvula
muestreadora
42
Columna
► Actualmente
todas las columnas son
de acero inoxidable 316 con
diámetro interno de 2.6 a 3 mm o 4.6
a 5 mm , casi todas con un diámetro
externo de ¼ de pulgada
43
Fase estacionaria
► Principales
parámetros de la fase
estacionaria
► Tamaño
de partícula: 3 a 10 µm
► Distribución de partícula : con una
desviación máxima del 10 %
► Tamaño de poro : 70 a 300 Å;
► Área superficial : 50 a 250 m2/g
► Densidad de la fase (numero de sitios activos
por unidad de área): 1 a 5 por 1 nm2
44
La tabla que se muestra presenta los parámetros principales de algunos
adsorbentes comerciales
Vporo Dporo
Área
Sup.
Distribución de
partícula
densidad
de la fase
ml/g
Å
m2/g
%
µM/m2
IB-Sil Phen.
0.75
125
165
5.5
2.74
Hypersil C4 (3)
0.6
300
50
2.0
4.80
Supelcosil C8 (3)
0.6
100
170
8.5
-
Spherisorb C8
0.5
80
220
6.0
2.51
Novapak C18
0.3
60
120
7.0
3.0
IB-Sil C18
0.75
125
165
11.0
3.27
Spherisorb C18
0.5
80
220
12.0
2.72
Prodigy C18
1.17
150
310
18.7
3.30
Inertsil C18
1.1
150
320
18.5
3.23
Hypersil C8
0.7
120
170
7.0
3.85
Hypersil C18 (3)
0.7
120
170
10.0
2.84
Selectosil C18
0.9
300
110
7.0
2.93
Nombre
45
Columna
► Fuentes
HPLC:
de daño de una columna de
 Obstrucción por partículas pequeñas en
los solventes o fases móviles
 Obstrucción por materiales no eluídos en
las muestras
 Variación de las características de
retención por incremento de materiales
no eluídos
46
Detectores
47
Detección
►
La eficiencia de un detector cromatográfico depende
de la relación entre la cantidad física medida y la
composición del efluente, así como también de las
características de las señal de transferida.
Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:
► Detectores basados en una propiedad de la fase móvil
. Ejemplo: Detector de Indice de Refracción
► Detectores basados en una propiedad de la sustancia
a separar.
Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector
Ultravioleta
48
Detección
► Detector
UV. Hay básicamente tres tipos:
 Detector de Longitud de Onda Fija
 Detector de Longitud de Onda Variable
 Detector de Arreglo de Diodos
49
Detección
► Detector
UV. Hay básicamente tres tipos:
Detector de Longitud de Onda Fija





El espectro se divide en :
infrarrojo (IR)
2,500 - 50,000
Infrarrojo cercano
800 - 2,500
Visible
400 - 800
Ultravioleta (UV)
190 - 400 nm
50
Detección
► Detector
de Índice de Refracción.
Existen muchos diseños de estos
detectores, pero solamente existen
ahora dos tipos:
 Tipo Deflexión
 Tipo Fresnel
51
Detección
► Detector
de Fluorescencia.
 Este detector solamente puede detectar
compuestos que tengan fluorescencia
nativa o inducida por derivatización .
► Detector
de Fluorescencia Inducida por
Laser
 Según la Fuente de Excitación
 Según el sistema óptico
52
Catálogo
► Revisar
catalogo
 Preparación de la muestra
 Características de columnas
 Aplicaciones especificas
53
Problemas más comunes
encontrados en HPLC
► Esta
es una lista de los problemas
normalmente encontrados en HPLC, sus
posibles causas posibles, y cómo
solucionarlos.
► Presión Alta
 Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC o
Guarda Columna por partículas.
 Solución: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente,
teniendo la columna desconectada del detector. Si esto no
funciona reemplace el fritado a la entrada de la columna. Si
la presión sigue alta reemplace la columna.
 Solución a largo plazo: Asegurase que todas las fases móviles
se filtren apropiadamente antes que entren a la bomba de
HPLC . También filtre todas las muestras antes de
inyectarlas.
54
Problemas más comunes
encontrados en HPLC
► Pérdida
de la Resolución
 Posible causa: Obstrucción de la Columna
de HPLC ó del Guarda Columna por
partículas.
 Solución: vea la sección de Presión Alta
 Solución a largo plazo: Filtrar todo antes de
que se introduzcan las fases móviles en el
sistema de HPLC.
55
Problemas más comunes
encontrados en HPLC
► Picos
Hendidos
 Posible causa : Obstrucción de la Columna
de HPLC o del Guarda Columna por
partículas.
 Solución: La columna se desatornilla. Si es
necesario reemplazar la columna.
 Solución a largo plazo: Filtrar todo antes
que se introduzcan las fases móviles en el
sistema de HPLC.
56
Problemas más comunes
encontrados en HPLC
► Variación
en los Tiempos de Retención
 Posible causa : Aire atrapado en la bomba
debido a gases disueltos en fase móvil.
 Solución: Degasificación de la Bomba
 Solución a larga plazo: Asegurase fase
móvil este propiamente y adecuadamente
desgasificada. Si usa desgasificación
electrónica en la línea asegurarse de que la
cadencia del flujo no es demasiado alto.
57
Problemas más comunes
encontrados en HPLC
► Variaciones
de la Línea Base
 Posible causa: Burbujas del aire atrapados
en la celda del detector debido a una mala
desgasificación de los solventes de la fase
móvil.
 Solución: Asegurese que todas las fases
móviles estén debidamente desgasificadas y
considerar el uso de un restrictor de la
presión a toma de corriente del detector.
58
Problemas más comunes
encontrados en HPLC
► Línea
Base con mucho Ruido
 Posible causa: Aire atrapado en celda del
detector o en la bomba.
 Solución: Enjuage el sistema y purge la
bomba de HPLC . Use Solventes
desgasificados adecuadamente para
mantener constante la velocidad de flujo de
la fase móvil del sistema.
59
Problemas más comunes
encontrados en HPLC
► Picos
Falsos (Detectores Electroquímicos y de
Fluorescencia)
 Posible causa: Oxígeno Disuelto
 Solución: Desgasificar adecuadamente las
fases móviles para reducir la concentración
de oxígeno disuelto.
 Solución a largo plazo: Agregar un sistema
de filtración al vacío en línea.
Periódicamente chequear el nivel de
oxígeno disuelto.
60
Problemas más comunes
encontrados en HPLC
► Baja
ó Ninguna Presión
 Posible causa: Trabajar con bombas, sellos
ó pistones expuestos por mucho tiempo a
partículas en suspensión en la fase móvil.
 Solución: Reemplace los sellos o pistones, si
es necesario.
61
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