Métodos espectroscópicos en
bioquímica
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Sensibilidad
Especificidad
Complementariedad
Velocidad
Accesibilidad
Precio
Representación
esquemática de las
características de las
proteínas globulares que
pueden seguirse durante
el plegamiento. Aunque
no hay una sola forma de
seguir todos los detalles
estructurales de un
intermediario del
plegamiento el uso de
sondas múltiples y
complementarias puede
brindar una imagen
detallada de la
distribución de
confromaciones que
componen los transitorios
del plegamiento
Current Opinion in
Structural Biology 1996,
6:630-636.
Citocromo c
Estructura de rayos X
Lisozima
Estructura de RMN
Estructuras por RMN
Átomos de la cadena para los
residuos 72-145 de las
estructuras en disolución de
apo-BsCopAb (a) y Cu(I)BsCopA(73-151) (b)
Representados como un tubo
de radio variable
proporcional al valor del
desvío estándar de la
posición de cada residuo. Se
muestran también las cadenas
laterales del Cys85, Cys88 y
el ion Cu(I).
J. Mol. Biol. (2002) 317, 415429
Citocromo c
Estructura de rayos X
Autoquenching
Cinética de plegamiento de
citocromo c en presencia y
ausencia de imidazol por
dilución de desnaturalizante
químico. Se mide la emisión
total de fluorescencia a l >
320 nm
FRET
TIBS (2000) 25; 631-637
Representación
esquemática de las
características de las
proteínas globulares que
pueden seguirse durante
el plegamiento. Aunque
no hay una sola forma de
seguir todos los detalles
estructurales de un
intermediario del
plegamiento el uso de
sondas múltiples y
complementarias puede
brindar una imagen
detallada de la
distribución de
confromaciones que
componen los transitorios
del plegamiento
Current Opinion in
Structural Biology 1996,
6:630-636.
Representación
esquemática de las
características de las
proteínas globulares que
pueden seguirse durante
el plegamiento. Aunque
no hay una sola forma de
seguir todos los detalles
estructurales de un
intermediario del
plegamiento el uso de
sondas múltiples y
complementarias puede
brindar una imagen
detallada de la
distribución de
confromaciones que
componen los transitorios
del plegamiento
Current Opinion in
Structural Biology 1996,
6:630-636.
Espectro Raman de
elastina bovina (en sólido)
en la región de 500 a 1750
cm-1 y asignaciones
propuestas.
Descomposición de las bandas amida I de elastinas
bovinas a, BE; b, BE-K. Perfiles experimentales (línea
continua) y calculados (línea punteada). Asignaciones
HW, agua de hidratación; a, hélice a; b, hebra b; U,
conformaciones no identificadas (giros + ovillo).
J. BIOL. CHEM. (1995) 270; 26099–26103
a-T-4K
-T-5K
R esu m en d e resu lta d o s d e estru ctu ra secu n d a ria d eriva d o s d e d icro ísm o circu la r:
Los porcen tajes se obtu vieron por d escom posició n espectral en espectros básicos
reportad os. O tra in d ica estru ctu ras d esord en ad as o n o asign ad as
H élice a
h oja b
G iro b
O tra
b -T-8 K (M 2 -M 3 )
85
—
15
—
b -T-1 0 K (M 1 -M 2 -M 3 )
80
—
20
—
a -T-4 K (M 4 )
87
—
13
—
-T-5 K (M 4 )
80
—
11
9
J. BIOL. CHEM. (1998) 273; 771–777
Espectros FTIR en la región de 1700 a
1540 cm-1. A, Proteína hp8 (no fosforilada,
línea continual), y PKAhp8 (fosforilada
(línea punteada). B, porcentajes calculados
de estructura secundaria en las muestras no
fosforiladas (barras blancas) y fosforiladas
(barras negras)
J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 2742–2751
Espectros de FTIR en el tiempo y
análisis cinético. (a) Espectros de
absorción a tiempos de 1.1, 3.4, 5.7,
10.2, 21.6 y 103 ms. Espectro antes de
mezclar (negro) con trifluoroetanol y
espectro final (verde). (b) Segunda
derivada de los espectros de a (líneas
continuas y los resultados de un ajuste
exponencial de tres estados
(punteado). (c) Los tres espectros
básicos resultantes del ajuste. (d)
Curso temporal de los tres estados
deducidos del ajuste.
PNAS (2001) 98; 6646–6649
Representación
esquemática de las
características de las
proteínas globulares que
pueden seguirse durante
el plegamiento. Aunque
no hay una sola forma de
seguir todos los detalles
estructurales de un
intermediario del
plegamiento el uso de
sondas múltiples y
complementarias puede
brindar una imagen
detallada de la
distribución de
confromaciones que
componen los transitorios
del plegamiento
Current Opinion in
Structural Biology 1996,
6:630-636.
Despliegue de
guanilato kinasa
inducido por cloruro
de guanidinio medido
por fluorescencia con
excitación a 282 nm
J. BIOL. CHEM. (1997) 272; 19343–19350
Intercambio de protones de amida
para hp8 luego de 5 minutos de
incubación con D2O a 25 ºC.
J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 2742–2751
290 nm
Espectros de RMN 19F del despliegue de
DHFR marcada con 6-19F-triptofano al
pasar de 0 a 5 M urea con mezcla rápida
a 22 ºC.
Intensidad de picos de resonancia
asignados a W30 y W47 en la
proteína desplegada. Hay una
primera fase demasiado rápida
para registrar con este método.
19
C o nstantes de velo cidad y am plitudes para el despliegue de D H FR m arcada co n 6 - Ftripto fano en urea 5 M .
M étodo
-1
-1
A1
k 1 (s )
A2
k 1 (s )
Fluo rescencia
0.205
0.727
0.795
0.014
D icro ísm o circular
0.199
0.499
0.801
0.014
R M N : T rp 22
0.237
ND
0.763
0.010
R M N : T rp 30 + 47
0.225
ND
0.775
0.015
R M N : T rp 74
0.252
ND
0.748
0.020
R M N : T rp 133
0.438
ND
0.562
0.015
Representación
esquemática de las
características de las
proteínas globulares que
pueden seguirse durante
el plegamiento. Aunque
no hay una sola forma de
seguir todos los detalles
estructurales de un
intermediario del
plegamiento el uso de
sondas múltiples y
complementarias puede
brindar una imagen
detallada de la
distribución de
confromaciones que
componen los transitorios
del plegamiento
Current Opinion in
Structural Biology 1996,
6:630-636.
Espectro visible de citocromo aa3
de P. denitrificans oxidado (a) y
reducido con ditionito (b). La línea
c es el espectro diferencial de la
forma reducida unida a CO menos
la forma reducida
J. BIOL. CHEM. (2002) 277; 13563–13568
Espectros de resonancia
raman de citocromo aa3
de P. Denitrificans
reducido (a) mutante
Y280H (b). Los
espectros c y d
corresponden al
complejo con 12CO y
13CO respectivamente.
El espectro diferencial
12CO 13CO aparecen en
e.
J. BIOL. CHEM. (2002) 277; 13563–13568
(A) Cobalamina(II) en solución ;
(B) Complejo enzima +
Cobalamina(II)
(C) Complejo enzima +
Cobalamina (II) + 5´desoxiadenosina
Biochem. J. (2001) 355, 131-137
Representación
esquemática de las
características de las
proteínas globulares que
pueden seguirse durante
el plegamiento. Aunque
no hay una sola forma de
seguir todos los detalles
estructurales de un
intermediario del
plegamiento el uso de
sondas múltiples y
complementarias puede
brindar una imagen
detallada de la
distribución de
confromaciones que
componen los transitorios
del plegamiento
Current Opinion in
Structural Biology 1996,
6:630-636.
Tiempos de correlación
Espectro de EPR del aducto
MNP/Hb a partir de la reacción de
Hb con peroxinitrito y comparación
con los aductos MNP/péptido
(A) Hb + ONOO- + MNP
(C) Igual que A + 0.5 mg/mL de
pronasa.
(E) Péptido GGYR (10 mM) +
ONOO- + MNP.
Biochemistry (1999) 38; 2078-2087
Técn ica
F lu o rescen cia
(i)
In trín seca
(ii)
u n ió n d e AN S
(iii)
Un ió n d e su strato
(iv)
FRET
(v)
An iso tro p ía
D icro ísmo circu lar
(i)
UV lejan o
(ii)
UV cercan o
In gen iería d e p ro teín as
E scala d e tiem po
n s– s
Amb ien te d e Trp y Tyr
E x p o sició n d e su p erficie h id ro fó b ica
F o rmació n d el sitio activo
D istan cias en tre resid u o s
Tiemp o d e co rrelació n
n s– s
D ep en d e d el méto d o d e
d etecció n
D isp ersió n d e rayo s X en án gu lo p eq u eñ o
Ab so rb an cia (UV cercan o )
> ms
n s– s
F TIR
RMN
(i)
(ii)
n s– s
tiemp o real
D in ámica
in tercamb io d e h id ró gen o (HX )
(i)
E stad o n ativo
(ii)
HX P u lsad o N M R
(iii)
HX P u lsad o E S I M S
E sp ectro sco p ía d e fu erza ató mica (AF M o
ten aza ó p ticas)
P arám etro estru ctu ral
observad o
ms– s
2 5 0 s
min – meses
ms– s
ms– s
s
F o rmació n d e estru ctu ra secu n d aria
F o rmació n d e estru ctu ra terciaria
F u n ció n d e cad a resid u o en la estab ilid ad
d e lo s in termed iario s y lo s estad o s d e
tran sició n
D imen sio n es y fo rma d el p o lip ép tid o
Amb ien te d e resid u o s aro mático s y
co facto res
F o rmació n d e estru ctu ra secu n d aria
Amb ien te d e resid u o s in d ivid u ales
An álisis d e fo rma d e lín eas d an velo cid ad es
d e p legamien to -d esp liegu e en las cercan ías
d el eq u ilib rio
E stab ilid ad glo b al y estad o s metaestab les
F o mació n d e en laces d e h id ró gen o en
resid u o s esp ecífico s
P o b lacio n es p legad as
F u erzas d e d esp liegu e y velo cid ad es d e
d esp liegu e d e mo lécu las ú n icas
T IB S 2 5 (2 0 0 0 );6 1 1 -6 1 8
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