Copurification of E.Coli RNAase
E and PNPase:
Evidence for a Specific
Association between two
Enzymes Important in RNA Processing
and Degradation
Agamenon J. Carpousis,
Griet Van Houwe, Claude Ehretsmann and Henry M.
Krisch. 1994
Introducción:
Degradación de mRNA
Disminución de
nivel de expresión
Regulación de la
Expresión Génica
Acción de Endo y
Exonucleasas
E.Coli: mRNA

Exonucleasas
Degradación desde
3` produciendo
mononucleótidos
La
mayoría de los mensajeros tienen
estructuras en sus extremos 3’ que pueden
impedir la acción de estas exonucleasas.

Endonucleasas adheridas se cree que inician la
degradación de ARNm por la creación de la
llamada entrada de sitios de 3’ exonucleasas.
RNAase E: Originalmente identificada como
una endoribonucleasa implicada en la maduración
de ARNr 5S
Subunidad 9S
ribosomal

Subunidad 5S
ribosomal
A cierta temperatura una deformación
termo-sensible del gen rne no produce el
ARN ribosomal 5S y se acumula su
precursor (ARN ribosomal 9S).
RNAase E- bacteriófago T4

Procesamiento y degradación de
varios mRNA
RNAase E- E.coli

Mutación ams afecta decaimiento
químico de mRNA

Mutaciones rne y ams en el mismo locus

Gen rne
Gen estructural
Resultados:
Purificación RNAase E



Método original
purificación no homogénea
(precipitación con sulfato
MM Nativa 70Kd
de amonio, cromatografía
de intercambio iónico y
gel filtración).
Gradiente de Glicerol
MM Nativa 300 Kd
Lysozyme-Edta, Triton, NH4Cl, detergentes no-iónicos e
inhibidores de proteasas
mayor rendimiento.
Ensayo de Actividad


Se estudio una forma truncada del ARNr 9S
como sustrato de la ARNasa E: 9Sa RNAase E
Sitios de corte: c, a, b
Procesamiento de 9Sa RNA
Wt HT
45ºC
Wt Rne
HT H T

Corte en a no se ve afectado por el sustrato

Carriles 2 y 3: tratamiento con calor de
RNAase
E
de
cepa
procesamiento de 9Sa


rne
reduce
1U de Actividad: Cantidad de RNAase E
que cliva completamente 9Sa en el sitio a
en 30 min a 30ºC
Ensayo de ACTIVIDAD en cada paso de la
purificación (tabla 1)
Tabla 1
9
1
2
0
0
Enz se purifica 130-veces
Figura A: SDS-PAGE Tinción con Coomassie
Figura B: Western blot
Producto
gen rne
Purificación de la ARNasa E WT
Polipéptido detectado similar se observó para enzima mutante
Procesamiento de ARN ribosomal 9S
45ºC







Gel electroforesis
desnaturalizante
Se detectó p5S: tiene 6nt
más que 5S
Identificación producto
basado en tamaño
Sitio a: GA/AUU
5’/a, 5’/c contienen
extremo 5’ de 9S
P5, c/a, b/3’, son internos
o del extremo 3’ de 9S
La enzima mutante es
inactivada por tratamiento
con calor (carril 3)
WT rne
Procesamiento del ARNm por la
ARNasaE








Mapeo in vitro del clivaje de
la ARNasaE A ) secuencia líder
5’ del bacteriófago T4 en gen
32; B)- secuencia líder 5’ E.coli
ompA.
B. secuencias sin enzima
Carril 1 y 2 digerido con wt
ARNasa E.
Carril 3 y 4 digestión con ARNasa
termosensible
+ Control: dideoxinuclotidos
fueron omitidos
ARN no marcado digerido
con fracción HT de wt y
sensible a temperatura.
Productos analizados por
extensión de primers.
Reacción de secuenciación
permitió determinar el sitio
de clivaje: GA/AUU(gen32)
y GG/AUU(ompA).
Detección de la actividad PNPasa




La PNPasa, exonucleasa que
degrada progresivamente el
ARN partir ext 3’ produciendo
mononucleotidos difosfatos.
Digestión del sustrato L168
marcado (α 32P)UTP, digerido
a 50º con fracción HT de wt
en el transcurso del tiempo.
Producto
analizado
en
cromatografia de capa fina.
Se observa actividad PNPasa
en la fracción HT.
Sedimentación del complejoARNasaEPNPasa sobre gradiente de glicerol



PNPasa residual es una forma de la enzima que no esta
asociada con la ARNasaE,por eso no es perturbada por la
desnaturalizacion del producto del gen rne.
La PNPasa-ARNasaE en 11-13 son parte de un gran
complejo proteico.
Dos posibles interpretaciones de la heterogeneidad:
- ARNasaE-PNPasa normalmente existen como una mezcla
de formas libres y complejos.
- Las formas libres son un artefacto debido a la perturbación
parcial del complejo proteico durante la purificación.
Imunoprecipitación del complejo ARNasa EPNPasa e identificación de las proteínas 85 y
45kd


Inmunoprecipitación
anticuerpo anti-hmp1.
con
La coprecipitación de los
polipéptidos de 180, 85 y
48 Kd, podría deberse a la
interacción específica entre
los mismos.
HT sirve como marcador y la posición de las
proteínas de 180, 85, 50, y 48 kd
B: Control sin antígeno
1: muestran la inmunoprecipitación de PNPasa
altamente purificada
2: wt de la fracción AP de nuestra preparación de
RNAasa E
3: entrada PNPasa
4: entrada de la fracción AP





La migración de los polipéptidos de 85 y 48 kd de la
preparación de PNPasa en el carril 3 es exactamente
igual que la de los polipéptidos de 85 y 48 kd en la
fracción HT.
Una comparación de los carriles 2 y 4 muestra que el
anticuerpo del anti-hmp1 precipitó selectivamente el
producto de 180 kd del gen rne y la subunidad catalítica
de PNPasa de 85 kd.
Estaba también clara en el gel original que era el
polipéptido de 48 kd immunoprecipitado.
El carril 1 es un control importante que muestra que el
anticuerpo del anti-hmpl no precipita los polipéptidos 85
y 48 kd en la preparación altamente purificada de
PNPasa.
La co-precipitación de los polipéptidos de 180, 85, y 48
kd en el carril 2 debe ser debida a una interacción
específica entre el polipéptido de 180 kd y los
polipéptidos de 85 y 48 kd.


Comparación de la proteólisis
limitada del polipéptido de 85
Kd de la fracción HT y PNPasa
con proteasa V8.
El polipéptido de 85 Kd es
aparentemente idéntico a la
subunidad catalítica de la
PNPasa (pnp)
1 y 2 son controles que muestran las proteínas
purificadas
3 y 4 muestran la proteólisis limitada de las
proteínas individuales con la proteasa V8
El carril 5 es la proteólisis de una mezcla igual de
cada proteína.
El carril 6 es un control que muestra la proteasa
solamente

La figura B muestra una comparación de la proteólisis limitada
de las proteínas de 85 kd de nuestra fracción HT y de PNPasa.

Estas proteínas fueron purificadas por SDS-PAGE.

En carriles 3-5, el patrón de productos es esencialmente igual
con solamente diferencias de menor importancia en la
intensidad de algunas bandas. Esto es probablemente debido
a variaciones pequeñas en el grado de la digestión.

Este experimento muestra que la proteína de
85 kd en nuestra preparación es al parecer
idéntica a la subunidad catalítica de la PNPasa
(pnpα). Este resultado fue confirmado usando
la papaína.


Proteólisis
limitada
del
polipéptido de 48 Kd con
V8.
El polipéptido de 48 Kd es
aparentemente idéntico a la
subunidad  de la PNPasa
(pnp ).
1 y 2 son controles que muestran las proteínas
purificadas
3 y 4 muestran la proteólisis limitada de las
proteínas individuales con la proteasa V8
El carril 5 es la proteólisis de una mezcla igual de
cada proteína.
El carril 6 es un control que muestra la proteasa
solamente


Autorradiograma de la
Inmunoprecipitación de la
ARNasaE parcialmente
purificada marcada
radioactivamente con 35S
metionina. Esta proteína fue
purificada con cromatografía
S-Sepharose.
pnp, pnp  y una proteína
de 50 Kd coprecipitan con el
producto del gen rne.
1: precipitación del control usando el
suero normal del conejo
2: precipitación con el suero del antihmpl
3: proteína radiactiva de la entrada.



El carril 1 muestra que no hay precipitación significativa
de las proteínas de entrada usando el suero del control,
mientras que el carril 2 muestra el pnpα, el pnpβ, y el
co-precipitado de la proteína de 50 kd del producto del
gen rne.
El carril 2 del autorradiograma fue explorado con
densitometría.
La única proteína detectada en los niveles significativos
funcionó cerca de 75 kd (carril 2, banda débil debajo del
pnpα). Está presente en alrededor de 10% la cantidad
de la subunidad del pnpα.
Caracterización de la forma proteolizada
de la ARNasa E





Sedimentación de una forma
degradada de la ARNasa E (ARNasa
E*) en un gradiente de glicerol.
ARNasa E purificada es muy
sensible a la proteólisis
ARNasa E* tiene altos niveles de
actividad endonucleasa y la misma
especificidad que la ARNasa E
intacta.
Análisis por Western blotting mostró
que los polipéptidos de 73 y 69 Kd
son producto de la degradación del
polipéptido de 180 Kd.
Como no se detecta los pl. de 85,
50 y 48 Kd y no hay actividad
PNPasa, los resultados indican que
la proteólisis del producto del gen
rne durante la purificación, puede
romper el complejo ARNasa EPNPasa.
Discusión
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


La copurificación y cosedimentación de la PNPasa con la ARNasa E,
sugiere que ambas enzimas son parte de un complejo proteico (CP).
El CP altamente purificado contiene 4 polipéptidos de 180, 85, 50 y 48
Kd. El de 85 Kd se identificó como pnp y el de 48 Kd como pnp .
El tratamiento con calor de la enzima producto del gen mutado resulta
en una inactivación de la misma. El mismo tratamiento de la enzima wt
no tuvo efecto en la actividad o en el complejo proteico.
La ARNasa E es muy sensible a la proteólisis durante la purificación.
ARNasa E* contiene pl. de 73 y 69 Kd que son fragmentos proteóliticos
del pl. de 180Kd.
ARNasa E* tenía un tamaño menor al del CP y no estaba asociada a la
PNPasa E. Estos resultados indican que el producto del gen rne puede
romper el CP ARNasa E-PNPasa y sugieren que el sitio catalítico de la
ARNasa E está localizado en un dominio de la proteína rne.





La ARNasa E estaría asociada a membrana ya que se requieren detergentes y alta
concentración de sales para su solubilización. El análisis de la forma degradada
sugiere que la proteólisis podría liberar el dominio del producto del gen rne que
contiene el sitio catalítico ARNasa E.
Posibles funciones del resto de la proteína: regulación de la actividad ARNasa e
interacción de la ARNasaE con la PNPasa u otras nucleasas.
La asociación física sugiere que las dos actividades tal vez actúan de forma
concertada durante el procesamiento y degradación del ARN.
La degradación se iniciaría por por la unión del CP. La ARNasa E realizaría un
endoclivaje y el nuevo extremo 3’ generado sería atacado por la PNPasa.
Una vez que actúa la exonucleasa, la ARNasa E se alejaría del complejo. Esto
permitiría la asociación de la ARNasa E con una PNPasa libre, comenzando
nuevamente el ciclo. También es posible que permanezcan asociadas durante
todo el proceso.
FIN
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