Una nueva proteína de U2 snRNP de
levadura, Snu17p, es requerida para
el primer paso catalítico del splicing
y para la progresión del ensamblaje
del spliceosoma
Gottschalk A., Bartels C., Neubauer G., Lührmann R.,
Fabrizio P.
Traído a ustedes por:
Matías Blaustein, Diego Pafundo, Ignacio Schor
Spliceosoma:
Asociación ordenada de 5 snRNAs
(U1, U2, U4, U5 y U6) y proteínas.
• 7 proteínas Sm, comunes a todos los
snRNPs
• Un set de proteínas Sm-like (Lsm)
• Otras
Secuencia de
eventos
Apareamientos y rearreglos entre los snRNAs
y el pre-mRNA
Muchas proteínas pueden estar involucradas en estos
switches… Por ejemplo:
Prp28p
Mediador potencial del switch U1 U6 del
pre-mRNA
Tiene un dominio DEAD-box ATPasa.
¿Desenrrollamiento del duplex RNA-RNA?
Caracterización de las proteínas del
spliceosoma:
• genética (en levaduras)
• bioquímica (en varios sistemas)
Así se encontraron muchas proteínas en levaduras
homólogas a las proteínas involucradas al splicing en
metazoos.
¿Qué pasa con la snRNP U2...?
• Se sabe poco del complejo de levaduras, porque es difícil de
purificar.
• Se caracterizaron 9 proteínas de este complejo en humanos.
• Todas tienen homólogos en levaduras (por búsqueda de
secuencias).
¿Qué se hace en este paper…?
Caracterización de una nueva proteína asociada al splicing:
Snu17p
¿De dónde salió Snu17p?
Purificación parcial
del tri-complejo
snRNP [U4/U6.U5]
por cromatografía de
afinidad y gradiente
de glicerol
Espectroscopía de masa
Búsqueda en base de datos
28 proteínas asociadas
con el tri-complejo
[U4/U6.U5]
Dos proteínas del
factor asociado a
U2 snRNPs, SF3b.
¡Snu17p!
¿Qué podemos saber de
Snu17p?
1
Snu17p tiene un motivo de reconocimiento de RNA (RRM)
Búsqueda de homólogos con BLAST de proteínas
50% de identidad con los primeros 120 aa de varias proteínas con RRM.
Búsqueda TBLASTN en base de datos de EST humanos
36% de identidad y 53% de similitud con EST AA314241
Este EST corresponde a una proteína llamada p14
que:
• tiene tamaño similar a Snu17p
• se encuentra asociada a U2 snRNP en humanos
p14 podría ser la verdadera ortóloga de
Snu17p en humanos
¿Está Snu17p
asociada con alguna
SnRNP?
Generación de una cepa de levaduras que expresa Snu17p-tag en
vez del gen endógeno
Preparación de extractos de splicing
Inmunoprecipitación con IgG-agarosa
Lavado con concentraciones crecientes de sales
Extracción de RNA y Northern blot
Snu17p es una proteína del snRNP U2
2
¿Está Snu17p asociada con
el spliceosoma durante el
splicing?
Pre-mRNAs de actina y de U3
marcados con 32P-UTP
Extractos de splicing
Splicing in vitro
Remoción:
20´
40´
40´: inmunoprecipitación
con IgG-agarosa
Electroforesis en gel desnaturalizante
3
Snu17p está asociada con el spliceosoma y en
particular con el catalíticamente activo durante el
splicing in vitro
3
Snu17p está asociada con el spliceosoma y en
particular con el catalíticamente activodurante el
splicing in vitro
3
Snu17p está asociada con el spliceosoma y en
particular con el catalíticamente activodurante el
splicing in vitro
3
Snu17p está asociada con el spliceosoma y en
particular con el catalíticamente activodurante el
splicing in vitro
¿Es esencial Snu17p para la
viabilidad celular?
Knockout de SNU17 en una línea diploide,
reemplazando por el marcador HIS3
Luego de la esporulación, las 4 esporas
son viables
Las dos esporas que llevan HIS3 tienen un
crecimiento vegetativo 1,3 veces más lento que el wild
type a distintas temperaturas
¿Es requerido Snu17p para
el splicing?
Extracción de RNA
Primer extension
Electroforesis en gel desnaturalizante
La deleción de Snu17p lleva a un splicing del premRNA defectivo in vivo
4. A
time
Pre-mRNA de actina marcado con
32P-UTP
Extractos de splicing de
cepas wt o snu17
Splicing in vitro
GST-Snu17p
Remoción:
1´
5´
15´
25´
Electroforesis en gel desnaturalizante
4. B
La deleción de Snu17p lleva a la inhibición del
splicing antes del primer paso catalítico in vitro
¿Afecta la ausencia de Snu17p
al ensamblaje del spliceosoma?
Pre-mRNA de actina marcado
+
Extracto de levadura wt
Extracto de levadura Snu17
Ensamblaje in vitro de spliceosomas (30°C)
0’
10’
20’
Heparina
Electroforesis en gel no
desnaturalizante
Visualización de los complejos
5. A
La ausencia de Snu17p produce
la acumulación de un complejo
inusual X.
¿Cuál es la composición del
complejo X?
Extracto de levadura wt
Extracto de levadura Snu17
Splicing in vitro con pre-mRNA de actina.
Tratamientos:
•Mock
•Degradando U6 snRNA
•EDTA
0’
5’
20’
Heparina
Electroforesis no desnaturalizante
Hibridar con sondas de actina y de todos los snRNAs
6
6
La estructura de U2 snRNP se encuentra
comprometida en ausencia de Snu17p
!!!
6
U1 snRNP es parte del complejo X, incluso
habiendo tratado con heparina.
!!!
6
6
6
U5 y U4 no se detectan bien
por el método anterior...
Extractos de splicing de
cepas wt o snu17
Pre-mRNA de actina biotinilado
Splicing in vitro
5L
RNA total
Heparina
120L
Gradiente de glicerol
15 fracciones de la región 40S
Northern blot
RNA purificado
Se purifica c/u por
afinidad con
streptavidina-agarosa
Este experimento independiente refuerza la conclusión
de que el complejo X contiene todos los snRNPs
7
Conclusiones
•Snu17p es llamada a partir de aquí ha ser tenida en cuenta como pilar
de U2 y resulta ser claro componente del spliceosoma, al menos hasta el
segundo paso catalítico del célebre y fundamental proceso de splicing.
•La falta de presencia de Snu17p trae aparejada una formidable
reducción del splicing in vitro. La mentada reducción es debida
directamente a la falta de presencia de Snu17p, ya sea porque Snu17p
es parte activa del extraordinario proceso de splicing o bien porque es
menester su presencia para la correcta conformación y funcionamiento
de U2.
•In vivo, si bien la falta de presencia de Snu17p produce un fenotipo de
crecimiento poco veloz y por demás evidentes defectos en el
majestuoso fenómeno de splicing, el efecto es menos drástico. Esto bien
puede explicarse por la estabilización de U2 en las condiciones
predominantes en el entorno fisiológico aún en ausencia de esta antaño
ignota proteína.
•La ausencia de Snu17p conlleva la formación de un ignominioso,
lindante con lo impúdico complejo que alberga en su seno a U2, U6, U5
e incluso a los usualmente esquivos U4 y U1. Esto puede deberse a una
conformación harto aberrante de U2 que no tiene a bien desplazar a U1.
Snu17p recombinante revierte la formación del esotérico complejo X y
restaura el magnánimo y fastuoso prodigio, conocido como splicing.
•Se puede colegir que la proteína p14 sería la contraparte funcional de
Snu17p en el spliceosoma humano (por identidad, similar talla y porte
y por permanecer asociado a U2).
•La falta de Snu17p, en marcado contraste con otras proteínas de U2,
permite la acción y efecto de incorporar U2 al prespliceosoma y del trisnRNP [U4/U6.U5] inhibiendo la progresión del ensamblaje antes de la
liberación de U1 y luego de la incorporación del tri-snRNP.
Notablemente, esto sentaría un hito para el perfeccionamiento de una
herramienta idónea para el aislamiento de spliceosomas totalmente
ensamblados, detenidos, congelados y acorralados antes del primer paso
catalítico del excepcional mecanismo de splicing.
Fin
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