MICROSCOPíA Y TÉCNICAS
DE ESTUDIO CELULAR
Microscopía -Resumen
Campo claro
Campo Oscuro
Ópticos
Contraste de fase
Confocal
Tipos de
microscopios
Fluorescencia
Electrónicos Transmisión
Barrido
Algunos Conceptos…
Magnificación
Aumento que logra el
equipo
Resolución (D)
Distancia mínima a la cual
el equipo puede mostrar
dos puntos como
entidades separadas
Algunos Conceptos…
¿De qué depende la resolución?
0,5 . λ
D=
n . senθ
¿Cómo
disminuir D?
Algunos Conceptos…
¿De qué depende la resolución?
D=
0,5 . λ
n . senθ
Longitud de onda
del haz de luz
FILTRO
AZUL
Algunos Conceptos…
¿De qué depende la resolución?
D=
0,5 . λ
n.
senθ
Objetivo
q
LENTE CON
AN MAYOR
muestra
Algunos Conceptos…
¿De qué depende la resolución?
D=
0,5 . λ
n . senθ
Índice de
refracción
ACEITE DE
INMERSIÓN
Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz
cuando pasa de un medio transparente a otro también
transparente. Este cambio de dirección está originado
por la distinta velocidad de la luz en cada medio.
nAire: 1 nAceite:1,5
Microscopio óptico
TORNILLOS DE
REVOLVER
EL PORTAOBJETOS
Microscopio óptico
Microscopio óptico - Campo claro - imágenes
Eosinofilia
Microscopio óptico – Campo oscuro
Objetos brillantes
sobre un fondo
oscuro
Observar organismos
vivos sin necesidad
de tinción
Microscopio óptico – Campo oscuro - Imágenes
Treponema pallidum
Microscopio óptico – Contraste de fase
Aumenta pequeñas diferencias en el índice de
refracción y densidad en la célula
Observar organismos
vivos sin necesidad
de tinción
El anillo forma un cono hueco de luz.
El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse
respecto del rayo que siga de largo
luz
sombra
Microscopio óptico – Contraste de fase
Microscopio óptico – Contraste de fase
Células HeLa (Henrietta Lacks)
Eritrocitos Humanos
Zygnema Filamentous Algae
Microscopio óptico – Interferencia
Mismo principio que el microscopio
de contraste de fase pero utiliza luz
polarizada
Permite la visualización detallada sin
teñir
Maximiza la diferencia entre los
índices de refracción entre las partes
de la muestra de forma de hacer
visibles los limites celulares
Microscopio óptico – Contraste de fase e interferencia - Imágenes
Contraste
de fase
Interferencia
diferencial
Microscopio óptico - Fluorescencia
Los objetos pueden también visualizarse
por la luz que ellos mismos emiten
Pasa sólo la λ que
permite la excitación
del fluorocromo
Restringe
infrarrojo
Microscopio óptico - Fluorescencia
Algunos “objetos” fluorescentes…
GFP
(Green fluorescent protein)
Aequoria victoria
Drpspphila
hela
Célula de cebolla (peroxisomas)
Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
Microscopía electrónica
Microscopía electrónica
Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Estructura interna y detalles ultraestructurales
Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Morfología y características de la superficie
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Bacilos en división
Mitocondria 60.000x
Bacteria fagocitada por un
macrófago
Herpes virus ensamblándose en el núcleo
Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Glomérulo renal 1200x
Espermatozoides bovinos
Célula en corte transversal
Piel humana
Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Bacterias sobre un estoma
Glób. Blanco
Célula vegetal con cristales (falsa tinción)
Glób. Rojo
Microscopía óptica vs. electrónica
Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas
 Elevados costos de los equipos y una
infraestructura adecuada no permiten el uso de la
técnica en cualquier laboratorio.
 Altos costos de procesamiento de las muestras
 La manipulación de reactivos se torna peligrosa por
la elevada condición tóxica de los mismos.
 Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de
artefactos
 La complejidad de los equipos requiere de personal
técnico especializado.
 Proporciona resultados de amplia resolución y
magnificación
Microscopía de fuerza atómica (AFM)
Microscopía de fuerza atómica (AFM)
Imágenes AFM de fibras de colágeno (izquierda) y ADN (derecha).
Imágenes AFM de una célula viva en un medio de cultivo (izquierda)
y cromosoma humano (derecha).
Microscopía de fuerza atómica (AFM)
AFM images of M13 phage and mtDNA. M13 phage genomes before (A) and
after (B) binding to SSB. Clayton et al, 2006.
Técnicas inmunológicas
Introducción a las Técnicas
inmunológicas
ELISA
Western blot
Dot blot
Inmunohistoquímica
Inmunofluorescencia
Citometría de flujo
Técnicas Inmunológicas - Inmunoglobulinas
Técnicas Inmunológicas - Producción de Inmunoglobulinas (anticuerpos)
Anticuerpo
Linfocito B
epitope
Activación
Antígeno
Técnicas Inmunológicas - Anticuerpos
Antígeno
Epitope A
Epitope C
Epitope B
Los antígenos suelen presentar múltiples copias del mismo epítope, y/o
presencia de múltiples epítopes que son reconocidos por múltiples
anticuerpos.
Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales
Antigeno
Activación
Linfocitos B
Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales
Sangre
Centrifugación
Suero
Purificación
Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales
Antígeno
Cultivo de células
tumorales
Sangrado
+
Purificación de
Linfocitos B
Fusión
Hibridoma
Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales
Hibridomas
Screening: Búsqueda de hibridoma
positivo y aislamiento
Purificación de anticuerpos monoclonales
del sobrenadante de cultivo de los
hibridomas
Técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA)
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)
Para detectar
Anticuerpos
Antígenos
ELISA
ELISA Para detectar Anticuerpos
Sensibilización
Bloqueo
Incubación con Suero
ELISA
ELISA Para detectar Anticuerpos
Lavado
Anticuerpo 2º
Revelado
ELISA
ELISA Para detectar Antígenos
Sensibilización
Bloqueo
Incubación con Suero
ELISA
ELISA Para detectar Anticuerpos
Lavado
Anticuerpo 2º
Revelado
Revelado – Detección Indirecta
Revelado:
Complejo biotina-avidina
Revelado – Detección indirecta
Antígeno
Ac. primario
Ac. secundario
Biotina
Avidina
Peroxidasa
Cromógeno
Cromóforo
Revelado – Detección indirecta
Formación de colores por la acción enzimática de distintos cromógenos
Ventajas ELISA
Muy sensible
Gran número de muestras
procesadas simultáneamente
Resultados rápidos
Cuantificación de sustancias
diversas (hormonas, fármacos, etc.)
Western blot
Western blot: identificación de proteínas
SDS - PAGE
Incubación
con Ab y
revelado
Transferencia
Gel
Transferencia
Membrana
Western blot
Bloqueo
Anticuerpo 1º
Biotina-avidina + peroxidasa
Anticuerpo 2º
biotinilado
Revelado
•Sustrato coloreado que precipita al reaccionar
•Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima
(revelado en placa radiográfica)
Ejemplo Western blot
Gel acrilamida
Membrana nitrocelulosa
Placas radiográficas
DAT
250
160
105
75
50
Actina
Dot blot
DOT BLOT
Variante de las técnicas de Southern,
Northern y Western blot
Identificación de moléculas
Dot blot analysis of proteins extracted from
wild-type spores and from spores exposing a
TTFC chimera. (Ricca and Cutting. Journal of
Nanobiotechnology 2003 1:6)
Inmunohistoquímica
Inmunohistoquímica: identificación en el tejido
Se corta en secciones muy
finas y se coloca en un
portaobjetos
Trozo de tejido
Anticuerpo 1º
Avidina-peroxidasa
Anticuerpo 2º
biotinilado
Revelado
Inmunohistoquímica - Revelado
Anti MMP-13 revelado con DAB
Contratinción hematoxilina
Inmunohistoquímica - Sustratos
Inmunofluorescencia
Fluoresceina
Rodamina
DAPI
Bromuro
de Etidio
Naranja
de Acridina
Ficoeritrina
Inmunofluorescencia
Rat neurons
N-myc/CD56
Inmunofluorescencia-colocalización
La colocalización permite
determinar si dos antígenos se
encuentran en el mismo lugar
(nucleo, vacuola, retículo, etc)
dentro de una célula
Inmunofluorescencia - colocalización
Citometría de Flujo
Citometría de Flujo
Célula
Medida
En movimiento
Medida de las propiedades de las células
mientras están en un flujo de líquido
Inmunophenotipificación
Viabilidad/apoptosis/Proliferación
Ciclo celular
Cambios en la superficie
Actividad enzimática
etc
Citometría de Flujo
Marcación con
anticuerpos
monoclonales
Mezcla de células
Citometría de Flujo
La presión ejercida por una columna de
fluido obliga a las células a “enfilarse” de
a una
Citometría de Flujo
Columna de células
Citometría de Flujo
Laser
Detector
Citometría de Flujo
Granularidad
La luz que se detecta a 90 grados del
haz del laser (side) es detectada por el
canal Side Scatter Channel (SSC)
La intensidad de la señal es
proporcional a la cantidad de
estructuras citosólicas en la célula
(gránulos, inclusiones, etc)
Tamaño
La luz que se detecta en la misma
dirección del laser (forward) es
detectada por el canal Forward Scatter
Channel (FSC).
La intensidad de la señal detectada se
relaciona con el tamaño, y el indice de
refracción de las células
Citometría de Flujo
Fluorescencia -Técnicas - Citometría de Flujo
Fluorescencia -Técnicas - Citometría de Flujo
Ejemplo:
Selección del sexo a través de
citometría de flujo de
espermatozoides
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