Universidad Nacional de La Matanza
Ciencias de la Salud - MEDICINA
AU1 - Formación del Ser Humano
Aplicaciones del diagnóstico
molecular en Genética
Dra. Mariana Herrera
1
DESORDENES MONOGÉNICOS
Aparecen cuando un gen está alterado
en todas las células del organismo
Las alteraciones se deben a mutaciones genéticas que son cambios
en las secuencias de los nucleótidos de la cadena de ADN
HERENCIA
AUTOSÓMICA
DOMINANTE
HERENCIA
AUTOSÓMICA
RECESIVA
HERENCIA LIGADA
AL X
HERENCIA
MITOCONDRIAL
Patrones de herencia de una
enfermedad monogenica
ENFERMEDADES DE ORIGEN POLIGÉNICO
Originadas por la sumatoria de efectos aditivos de varios genes y
de factores ambientales que las favorecen
La recurrencia en un grupo familiar se establece en función de
tablas estadísticas específicas de cada desorden.
Enfermedades de origen poligénico analizables
por Biología Molecular
Diabetes juvenil
Alzheimer
Enfermedad celíaca
Enfermedad cardiovascular
Parkinson
AMPLIFICACION DEL ADN
PCR: reacción en cadena
de la polimerasa
-ADN total
-Taq polimerasa
-Mg
-Buffer
-Primers
Ciclos:
-Desnaturalización
-Hibridación
-Elongación
Pocas copias de un fragmento
Millones de copias
PCR
10 rep
20 rep
20 rep
10 rep
5’
3’
DNA diana
3’
5’
Separación de las cadenas
Desnaturalización
Forward primer
3’
5’
Pegador de los
primers
(annealing)
5’
3’
3’
5’
Reverse primer
Hacer copias
(extensión)
Las copias de PCR se incrementan exponencialmente con el
número de ciclos
Thermal cycle
En 32 ciclos se hacen más de 1000 millones de
copias (2 n = 2 32 copias)
Ejemplos de diagnósticos que se hacen
por PCR (monogénicas)
- Distonía de torsión temprana (autosómica
dominante)
- Ataxia de Friedreich (autosómica recesiva)
- Enfermedad de Duchenne (ligada al X)
Distonía primaria (DYT1)
Deleción de tres pares de bases (GAG) en el gen DYT1
Frecuencia
Herencia
Técnica
72% de los pacientes
con distonía primaria de
comienzo temprano
autosómica dominante
PCR y corrida electroforética
en geles de poliacrilamida
Se amplifica un fragmento de 250 pares de bases que contiene al triplete GAG con una PCR
radiactiva y se corre en un gel de poliacrilamida.
Distonía primaria (PTD)
Ctrol
N/M
Padre Madre Hijo
Hija
250 pb
247 pb
Se han descripto numerosos casos de
aparición de novo de esta deleción
Microsatélites
Son repeticiones de di, tri o tetranucleótidos
un número n de veces
dinucleótidos: ---ATATATAT(AT)n-----CGCGCGCG(CG)n
trinucleótidos: ---CAGCAGCAG(CAG)n-----CCTCCTCCT(CCT)n---
tetranucleótidos: --(CATG)n-- ó --(CCGG)n--
Características:
-Hay alelos con distinto
número de repeticiones
-Se heredan mendelianamente
-Muchas enfermedades
neurológicas se originan por un
incremento anormal del
número de repeticiones
Southern Blot
•
•
•
•
•
Extracción de una gran cantidad de ADN genómico total
Digestión con enzimas de restricción
Corrida electroforética
Transferencia a una membrana de nylon
Identificación de una zona específica del ADN con
sondas marcadas
• Se usa en diagnósticos de enfermedades como la
Distrofia Miotónica.
FUNDAMENTOS DE LA TECNICA DE Southern Blot
Corte mediante enzimas de
Restricción.
SOUTHERN BLOT
Distrofia Miotónica (DM)
Secuenciación del ADN
• Manual o automática
• PCR con nucleótidos especiales
• Permite conocer la secuencia exacta de
pares de bases en un fragmento de ADN
Tecnología de Microarrays
•
Está basada en la idea de Southern de que moléculas de
ADN marcadas pueden ser usadas para analizar otras
moléculas de ADN unidas a un soporte sólido
•
El “Southern blot” fue el primer array
• Análisis de expresión hibridando moléculas de ARNm a
librerías de ADNc sobre membranas de nylon
• Dot-blot con sondas ASO
Paneles de riesgo para enfermedades complejas:
-Enfermedad arterial coronaria
-Infarto de miocardio
-Fibrilación auricular
-Cuadro trombótico
-Enfermedad arterial periférica
Estudio de portadores de mutaciones recesivas (Panel
Ashkenazi):
Tay Sachs, Canavan, Gaucher, Galactosemia, Disautonomía
Familiar, Bloom, Nieman Pick, Fibrosis Quística,
Mucolipidosis, etc.
Al leer el informe de un estudio
genético:
• ¿Qué mutación/es se estudió/aron?
• Si no se encontró ninguna mutación, ¿se
puede descartar la enfermedad?
• ¿Qué técnicas se usaron? ¿Es la técnica
adecuada para el/la paciente?
• ¿Cuál es el grado de informatividad del
estudio?
• ¿Existe una buena correlación
genotipo/fenotipo?
DIFERENCIAS ENTRE
POLIMORFISMO Y MUTACIÓN
94%
99.9%
0.1%
6%
TIPOS DE POLIMORFISMO
Polimorfismo de secuencia
Polimorfismo de longitud
-----AGACTAGACATT----
-----(GATA)(GATA)(GATA)----
-----AGATTAGACCTT----
-----(GATA)(GATA)--------(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )----
A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadena
del ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).
¿Cómo se transmiten los caracteres
hereditarios de generación en generación?
Padres
Hijos
La Herencia de los Genes.
La Fecundación
+
n
n
ESPERMATOZOIDE
23 CROMOSOMAS
+
=
2n
Organismo unicelular.
Embrión
ÓVULO
23 CROMOSOMAS
HIJO
23 PARES DE
CROMOSOMAS
La herencia de los genes
Gen de “la bondad”
GAMETAS
FEMENINAS
GAMETAS
MASCULINAS
Gen de “la bondad”
“mucha bondad”
“mediana bondad”
“poca bondad”
“excesiva bondad”
Cada variante se denomina alelo.
Imaginando este ejemplo, el gen de “la bondad” presenta cuatro
alelos: “mucha bondad” “mediana bondad” “poca bondad” “excesiva
bondad”.
“La bondad” de un hijo es el resultado de la interacción de los genes de la
bondad que recibió de sus progenitores.
Gen “La bondad”
Gen “La Inteligencia”
Gen “La Belleza”
Variantes Alélicas
Mucha Bondad
Gran Inteligencia
Extremada Belleza
Mediana Bondad
Inalcanzable Inteligencia
Amigable Belleza
Poca Bondad
Incomparable Inteligencia
Mínima Belleza
Excesiva Bondad
En cada individuo este grupo de genes puede presentarse con diferentes
combinaciones.
Cuando más loci o genes se investiguen mayor será la caracterización de
la persona y menor será la posibilidad de encontrar dos personas que
compartan exactamente las mismas características.
Los estudios de identificación biológica permiten determinar la huella
propia de un individuo y reconocer el 50 % heredado de la madre y el 50
% heredado del padre.
Un fragmento de ADN
se
repite n veces “en tandem”. El número
de repeticiones en que se encuentra se
corresponde con un alelo.
Los STRs
Locus
preciso
De acuerdo a las leyes de la
herencia, cada individuo
tiene dos alelos, uno
heredado de su madre y el
otro de su padre
Se observan alelos de 2, 3, 4, 5 y 6
repeticiones entre los individuos.
Pequeñas cantidades de ADN
Grandes cantidades de ADN
Los dos
alelos de un
STR de un
individuo
PCR
10 rep
20 rep
20 rep
10 rep
Material biológico a partir del cual pueden
realizarse los estudios de identidad.
Óvulo materno
Infinitas divisiones
celulares
+
espermatozoide paterno
Puede utilizarse
cualquier tejido para
analizar su ADN.
El niño tiene en todas
las células de su
organismo la misma
información genética
que en la célula
originaria
P+H+M
Estudio de Paternidad.
Toma de muestras:
LABORATORIO
FORMULARIO
Nombre completo
Fecha de nacimiento
Nro. de Documento
Relación con el Probando
Huella digital
Foto
Firma
sangre, cepillado
bucal o uñas
Preparación del ADN de las
tres personas
P
H
M
UTOMÁTICO
ESTUDIO DE MATERNIDAD
Herencia del Cromosoma Y
Estudio de la Línea Paterna
Todas las células
masculinas tienen un
cromosoma sexual X y
uno Y (XY)
Todas las células femeninas
tienen dos cromosomas
sexuales X (XX)
Las gametas masculinas
(espermatozoides) llevan o
un cromosoma X o un
cromosoma Y
Las gametas femeninas
(óvulos) llevan siempre un
único cromosoma X
X
X
+
X
X
+
Y
MUJER
VARON
X
Y
Herencia del Cromosoma Y
XX
XY
XX
XY
XY
XY
XX
XY
ABUELO, HIJOS VARONES, NIETOS VARONES, HERMANOS
VARONES, PRIMOS VARONES POR VIA PATERNA, TIO PATERNO
Y SOBRINO, COMPARTEN EL MISMO CROMOSOMA Y
El ADN mitocondrial
presenta pequeñas
regiones diferentes
entre las personas
mitocondrias
núcleos
espermatozoide + óvulo
fecundación
Primer célula embrionaria que
originará todo el embrión
Herencia Mitocondrial
Estudio de la Línea Materna
DNA
MIT.1
DNA
MIT.5
DNA
MIT.1
DNA
MIT.5
DNA
MIT.2
DNA
MIT.3
DNA
MIT.1
DNA
MIT.4
DNA
MIT.1
DNA
MIT.1
POLIMORFISMO DE UN GEN
Está dado por las diferentes variables
en que se presenta en la población.
TIPOS DE POLIMORFISMO
Polimorfismo de secuencia
Polimorfismo de longitud
-----AGACTAGACATT----
-----(GATA)(GATA)(GATA)----
-----AGATTAGACCTT----
-----(GATA)(GATA)--------(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )----
A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadena
del ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).
En cada individuo este grupo de genes puede
presentarse con diferentes combinaciones.
Los seres humanos compartimos el 99,9% de nuestro genoma. Las diferencias
responden a variaciones en tan solo el 0.1 % de la secuencia del ADN.
DIFERENTES ALELOS EN LA
POBLACIÓN
PROYECTO GENOMA HUMANO
A partir de la secuenciación completa del genoma humano se ha
determinado que existen aproximadamente 30.000 genes.
Se encontraron más de 6.000.000 sitios con SNPs
Pero lo importante fue entender cómo las diferentes variantes alélicas
de un gen polimórfico se relacionan con características particulares
de las personas.
AAACCGG Bondad alta
AAAACGG Bondad media
TTTGGCC
TTTTGCC
Proyecto Genoma Humano
GWAS (Genomic wide association studies)
Farmacogenética
Farmacogenética: reducción de riesgos de la terapia
Comparación de riesgos fatales
Incremento del riesgo fatal (anual)
1 en 107
1 en 106
Electrocución
1 en 105
Accidente
aéreo
1 en 104
1 en 103
Asesinato Accidente de
coche
Farmacogenética
Reacción fatal frente
al fármaco prescrito
Fuente: Consumer Reports
1 en 102
El genotipo: impacto significativo en el
metabolismo de fármacos
Concentraciones de fármaco según Fenotipo Metabolizador
Fenotipo metabolizador Genotipo
Tipo de respuesta a dosis típicas
= Reacciones adversas
Ultrarrápido
Conc.
= Intervalo terapéutico
= No efectivo
Tiempo
= Reacciones adversas
Eficiente
Actividad
normal
Activida
d
= Intervalo terapéutico
= No efectivo
reducida
Intermedio
Lento
= Reacciones adversas
no
actividad
= Intervalo terapéutico
= No efectivo
= Reacciones adversas
= Intervalo terapéutico
= No efectivo
Consecuencias de un polimorfismo genético:
La presencia de uno u otro polimorfismo PUEDE RESULTAR INDIFERENTE.
Si afectan a la secuencia codificante PUEDEN PRODUCIR cambios importantes en
la estructura de la proteína.
Si afectan a la secuencia reguladora del gen PUEDEN MODIFICAR su expresión.
Los polimorfismos genéticos también llamados variaciones genéticas se
relacionan, entre otras cosas, con el metabolismo de los medicamentos
antineoplásicos e influyen en su toxicidad y respuesta a la quimioterapia
en pacientes con cáncer.
TIOPURIN METIL TRANSFERASA: TPMT
Thiopurine Methyltransferase (TPMT) Gene
Enzyme Activity Levels in 300 Caucasian Patients
100
c
90
80
% of Subjects
70
60
50
40
30
20
10
b
a
0
low
medium
TPMT Enzyme Activity
high
Inherited differences
in Metabolism
10
dose (mg/day)
Th
80io p u rin e M eth yltran sferase
(T70P M T )Optimal
P o lym oDose
rp h ism
foraffe cts
6M P P h armEach
aco dChild
y n am ics
60
50
Gene for TPMT has
TPM T
40 M P variant
M eM P
A common
that
30
Causes
low activity,
High
of 6MP
20 levels
HPRT
Metabolites
10
0
DNA
in corporation
mut/mut
wt/mut
TGNs
8
6
4
Relling & Dervieux Nature Ca
Rev 2001;1:99-108
w t/m
2
m /m
0
0
5
10
15
20
25
30
T P M T A ctivity
Inherited differences
In drug levels
200 0
wt/wt
10 00
0
Le uke m ia 1 4:56 7 -72 , 2 00 0
w t/w t
M u t/M u t
W t/M ut
W t/W t
m ye losu ppression
toxicity
risk seco ndary cancer
risk o f re lapse
UDP-glucuronosiltransferasa
UGT1
Drogas que presentan en sus prospectos la recomendación por la FDA
De estudio farmacogenético antes de medicar.
ENZIMA
POLIMORFISMO FARMACO
CONSECUENCIA
UDP-glucuronosiltransferasa
Secuencias TA
repetidas
Irinotecan
Inestabilidad
proteica. Diarrea,
mielo depresión.
Mutación
Puntual
Fluoropirimidinas
Neurotoxicidad,
mielo depresión.
UGT1
Dihidropirimidina
Deshidrogenasa (DPD)
http://www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ResearchAreas/Pharmacogenetics/ucm083378.htm
REACCIÓN AL MEDICAMENTO
Nombre del medicamento
Análisis genético para:
Resultados del análisis
Abacavir
Hipersensibilidad
El alelo HLA-B*5701 se asocia a mayor riesgo
de presentar hipersensibilidad al abacavir.
Antibióticos aminoglucósidos
Pérdida auditiva
Polimorfismo asociado a la pérdida auditiva
como consecuencia del tratamiento con
antibióticos amigo glucósidos.
Cafeína
Metabolismo
Polimorfismo asociado a ser metabolizador
lento de la cafeína, y riesgo de toxicidad y
riesgo de sufrir un infarto cardíaco.
Carbamazepina
Hipersensibilidad
El alelo HLA-B*5702 está asociado a la
hipersensibilidad a la carbamazepina.
Clopidogrel
Metabolismo
Polimorfismo asociado a la respuesta.
Metotrexato
Toxicidad
Polimorfismo asociado a riesgo de toxicidad
inducida por el metotrexato.
LAS PREDICCIONES YA ESTÁN HECHAS
QUÉ FALTA PARA APLICAR ESTOS ESTUDIOS
PREVIO AL TRATAMIENTO?
Pacientes con genotipos tratados de acuerdo a
las predicciones.
Pacientes sin genotipos y tratamiento clásico
La farmacogenética, mejora la efectividad del
tratamiento?
EJEMPLOS DE ASOCIACIONES GENÉTICAS
GEN PPARG (PEROXISOME PROLIFERATOR ACTIVATED RECEPTOR GENE)
-El alelo C codifica para una Prolina en el codon 12 en lugar de una Alanina.
-PPARG asociado a la reducción de el peso corporal en respuesta a la restricción calorica.
-Polimorfismo Pro12Ala asociado a Sindrome Metabolico, Resistencia a la Insulina y diabetes tipo 2 en
población sana.
GEN APOA-2: GEN DE LA APOLIPOPROTEINA A2
-Presencia de una C en lugar de una T en el promotor del gen.
-Genotipo C/C :
-Influye en la obesidad y el riesgo cardíaco.
GEN ADIPOQ: GEN DE LA ADIPONECTINA
-Presencia de una G en lugar de una A en la posición -11391 G/A, en el gen ADIPOQ.
-Tendencia a recuperar el peso perdido inmediatamente.
-Riesgo de Resistencia a la insulina y syndrome metabolico.
-Alelo A da protección a la recuperación del peso luego de 32-60 semanas luego de dieta baja en
calorías.
GEN MCM6: minichromosome maintenance complex component 6.
-El a alelo C en lugar del T en la posición -13910 del gen MCM6.
-Influye sobre el gen LCT y se asocia a hipolactasia o intolerancia a la lactosa.
EJEMPLO / REACCIONES A ALIMENTOS
INTOLERANCIA A LA LACTOSA
La intolerancia a la lactosa es la capacidad de digerir
la lactosa, que es el azúcar que se encuentra en la
leche y los productos lacteos. Esta condición se debe
a la falta de una enzima llamada lactasa. La variante
genética rs4988235 está situada cerca del gen de la
lactasa (LCT), en el gen MCM6, y se ha demostrado
que nivela los niveles de lactasa en el organismo . Las
personas con el genotipo C/C (marcador genético
rs4988235) tienen una “Mayor probabilidad” de ser
intolerantes a la lactosa, mientras que las personas
con otro genotipo tienen una “Menor probabilidad” de
ser intolerantes a la lactosa.
Esta variante se ha asociado con la intolerancia a la
lactosa en estudio de personas caucásicas, mientras
que otras variantes podrían tener un papel importante
en otros grupos étnicos.
SU RESULTADO
MAYOR PROBABILIDAD
Las personas con su mismo genotipo
tienen un probabilidad mayor de ser
intolerantes a la lactosa y pueden
sufrir efectos secundarios al ingerir
lactosa, que es el azúcar que se
encuentra en la leche.
GENES RELACIONADOS
Gen
analizado
MCM6-rs498835
Su
Genotipo
C/C
Valor
Científico
****
www.SNPedia.com
[PMID 18959602]
PMID, acrónimo de «PubMed Unique Identifier», es un número único asignado a cada cita de
un artículo de revistas biomédicas y de ciencias de la vida que recoge PubMed.
PubMed es un motor de búsqueda de libre acceso a la base de datos MEDLINE de citaciones y
resúmenes de artículos de investigación biomédica. Ofrecido por la Biblioteca Nacional de
Medicina de los Estados Unidos como parte de Entrez. MEDLINE tiene alrededor de 4.800
revistas publicadas en Estados Unidos y en más de 70 países de todo el mundo desde 1966
hasta la actualidad.
EJEMPLO / NECESIDADES NUTRITIVAS
VITAMINA B12
En múltiples estudios genéticos se ha identificado a un
marcador en el gen FUT 2, que está asociado a niveles
bajos de Vitamina B12 en sangre. Esto se puede deber
a una absorción deficiente de la vitamina en el
intestino. Se recomienda a las personas con genotipos
G/G o A/G “Ajustar el consumo” porque es probable
que tengan niveles bajos de Vitamina B12. El consumo
de cereales enriquecidos con vitamina B12 puede
ayudar a obtener niveles adecuados, sobre todo en
personas mayores de 50 años.
Las personas con este mismo
genotipo tienen mayor probabilidad de
presentar niveles mas bajos de
vitaminas B12 en sangre. Se puede
ajustar el consumo de la vitamina B12
poniéndole ingiriendo alimentos ricos
en vitamina B12.
GENES RELACIONADOS
Gen
analizado
FUT2-rs602662
Su
Genotipo
A/G
Valor
Científico
****
ASOCIACIÓN ENTRE LOS NÍVELES DE VITAMINA B12 EN PLASMA
CON LOS GENOTIPOS DEL GEN FUT2.
(MUJERES DEL GWAS Y REPLICA EN OTROS ESTUDIOS)
SNP Association EDAD
by Study
N
FRECUENCIA
DEL ALELO
Gly=0.49
Total
(Gwas+
Grupo replica)
Ser/Ser
A/A
Ser/Gly
G/A
ESTIMADO
(S.E.)
P-VALOR
Gly/Gly
G/G
AJUSTE EL CONSUMO
rs602662GWAS
NHS CGEMS
CANTIDAD PG/ML
59
1,658
489.82
487.72
418.67
417.05
413.35
413.52
-0.08(0.01)
6.54x10-10
-0.08
3.52x10-15
Ante la necesidad de un estudio genético:
-La información siempre debe estar mediada por el médico.
-Es el médico quien debe asesorar al paciente respecto de las
conveniencias y los riesgos de someterse a una prueba genética.
-Explicar muy bien el significado de un estudio de asociaciones. -No caer en la GENOMANÍA.
-Recordar que la genética es sólo una parte de lo que somos
fenotípicamente y que el medio ambiente juega un rol
importantísimo tanto en la expresión de nuestros genes
(epigenética) como en los riesgos de desarrollar enfermedades
complejas (cáncer, diabetes, enf. Cardíaca, etc).
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