Evolución dirigida de Saccharomyces cerevisiae en cultivo continuo para la
adaptación a la primera fase de la fermentación alcohólica de mosto de uva.
Mangado, A.,Novo, M.T.,Wapenaar, M.,Morales, P.,Quiros, M.,Salvadó, Z., Gonzalez, R.
Departamento de genómica funcional aplicada a la invest. enológica
CSIC – Instituto de las Ciencias de la Vid y el Vino. CSIC-UR-GR. Edificio CCT.
C/ Madre de Dios 51. 26006 Logroño. Tfno. 941 29 9. [email protected]
INTRODUCCION
A lo largo de su evolución, las levaduras enológicas han desarrollado mecanismos
de adaptación a distintas condiciones ambientales de estrés, manteniendo su
integridad celular y su actividad metabólica durante todo el proceso fermentativo.
Pero la pregunta es como estos organismo alteran su genoma en respuesta a la
presión selectiva de su medio ambiente.
RESULTADOS
De cada evolución se eligieron 36 cepas al azar, estas fueron analizadas por
turbidometria en un nefelómetro para medir el crecimiento de estas respecto a la wild
type.
Se seleccionaron 4 cepas que se vieron mejoradas respecto a este en las primeras
horas de crecimiento, como se puede ver en el ejemplo para la selección de una de las
evoluciones,Fig 1 y para las cepas seleccionasdas Fig 2.
NTUs
225
NTUs
200
200
175
Dado que las condiciones ambientales, en concreto la composición del medio de
cultivo, sufren importantes cambios a lo largo de la fermentación, éstas
adaptaciones responden a diferentes factores y pueden ser distintas en función de
la etapa del proceso que se considere.
175
150
150
125
125
100
100
75
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50
25
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0
25
1
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0
1
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20
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24
tiempo (horas)
BY4741-1
BY4741-2
BY4741-3
AV5.1
AV5.2
AV5.3
AV7.1
AV7.2
AV7.3
AV 8.1
AV 8.2
AV 8.3
AV6.1
AV6.2
AV6.3
Fig 1. Nefelometria medida a lo largo de 24 horas para
la cepa By4741 (wild type) y para 4 cepas evolucionas
AV5, AV6, AV 7, AV 8.
perdida de peso/volumen (g/ml)
Cepas enológicas diferentes pueden mostrar rasgos adaptativos óptimos para
diferentes momentos del proceso. Esto puede explicar en parte la sucesión de
cepas de Saccharomyces cerevisiae que tiene lugar en las fermentaciones
0
espontáneas de mosto de uva (Querol et al., 1992).
MATERIAL Y METODOS
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
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tiempo (horas)
BY4741-1
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E18
E18
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AV-16
AV-8
AV-16
AV-8
AV-16
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BV-19
BV-19
BV-19
24
Fig 2. Nefelometria medida a lo largo de 24 horas para la
cepa By4741 (wild type) y las 4 cepas seleccionadas para el
estudio.
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0
La cepa de estudio es una cepa de laboratorio de la especie Saccharomyces
cerevisiae derivada de S288C, BY4741. Esta levadura fué sometida a un cultivo
continuo emulando las condiciones de la fase de crecimiento exponencial durante
una vinificación. El cultivo contino se realizo a una D= 0,20 h-1 en un mosto
sintético con un 20 % de azucares, suplementado para los requerimientos de la
cepa. El ensayo se realizo por triplicado, llegando a obtenerse poblaciones de entre
150-230 generaciones.
EVALUACION FENOTIPICA
Se realizaron ensayos de nefelometria en mosto para comprobar el crecimiento de la
mutantes respecto a la wild type. Se eligieron 4 cepas y se determinó su tasa de
crecimiento y la cinética inicial de ferementación.
La perdida de CO2 se midió como perdida de peso cada 24 horas.
El crecimiento celular se monitorizó a 600 nm en un lector de microplacas
SPECTROstar Omega instrument (BMG Labtech, Offenburg, Germany). Para cada
cepa se realizaron 8 repeticiones, para estudiar los parametros de crecimiento se
utilizó la ecuación modificada de Gompertz propuesta por Zwietring et al (1990). Los
datos experimentales se ajustaron a los modelos utilizando la regresión no
lineal, usando spss 15.0.
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
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30
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tiem po (días)
By4741-1
By4741-2
By4741-3
E18-1
E18-2
E18-3
AV8-1
AV8-2
AV8-3
AV16-1
AV16-2
AV16-3
BV19-1
BV19-2
BV19-3
Fig 3. Cinetica de fermentación de los mutantes
seleccionados y del wild type.
Resultados preliminares indican que la adaptación a esta primera fase no supone, más
bien al contrario, un acortamiento del tiempo total de fermentación (Fig 3). Siendo
posiblemente una adaptación a solo las primeras horas, entendiendose esto como una
mejora durante la fase exponencial, pero no durante el resto de la fermentación.
Los datos obtenidos en el lector de microplacas fueron ajustados a un modelo
primario de crecimiento mediante la ecuacion de Gompertz utilizando la regresión no
lineal. Estos datos fueron analizados mediante un test ANOVA y comparados
mediante el test de Scheffe Los valores de la asintota superior (A) no mostraban
homogeneidad de varianzadas por lo que no fueron analizados.
Tanto la tasa de crecimiento (mu= (lnx1-lnx0)/dt ), como la lag fueron significativos
para un intervalo de confianza del 95% (P= 0.000 y P= 0.001 respectivamente). El test
de comparaciones multiples reveló diferencias significativas entre la cepa wild type y
tres de las cepas evolucionadas para la tasa de crecimiento y entre la wild type y una
de las cepas evolucionadas para la fase lag. Tablas 1 y 2.
Subconjunto
Subconjunto
muestra
EVALUACION GENOTIPICA
El DNA de cuatro cepas de las tres evoluciones dirigidas y el wild type fue
secuenciado y comparado mediante alineamiento global.
La extracción y purficación del DNA se realizo con un Kit DNeasy plant Minikit
(Quiagen).La secuenciacion se realizó con por el método de terminadores
reversibles con la plataforma Illumina de Solexa.
Scheffe(a,b,c)
muestra
N
1
2
BY 4741
8
0,1683
AV 8
8
0,2254
BV 19
1
N
1
2
BV 19
8
2,9206
0,2254
BY 4741
8
3,2379
8
0,2569
AV 8
8
3,4150
3,4150
E18
8
0,2760
E18
8
4,1253
4,1253
AV 16
8
0,2779
AV 16
8
0,3433
Significación
Significación
0,2614
Scheffe(a,b,c)
1
4,9575
0,2041
0,0546
Tablas 1y 2. Compraciones multiples mediante el test de Scheffe de los valores de µ y lag.
CONCLUSIONES
En cada uno de los procesos ha sido posible obtener varias cepas mejoradas respecto a la original en cuanto a su capacidad de crecimiento inicial en mosto modelo, tal como se ha
determinado por su tasa de crecimiento y la cinética inicial de fermentación.
Querol, A., Barrio, E., Huerta, T., Ramón, D. 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58:2948-2953.
Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., & Van't Riet, K. 1990. Appl. Environ. Microbiol., 56(6), 1875-1881.
AGRADECIMIENTOS:
Este trabajo ha sido financiado por el MICINN, proyecto AGL2009-07327.
Evolución dirigida de Saccharomyces cerevisiae en cultivo continuo para la
adaptación a la primera fase de la fermentación alcohólica de mosto de uva.
Mangado, A.,Novo, M.T.,Wapenaar, M.,Morales, P.,Quiros, M.,Salvadó, Z., Gonzalez, R.
Departamento de genómica funcional aplicada a la invest. enológica
CSIC – Instituto de las Ciencias de la Vid y el Vino. CSIC-UR-GR. Edificio CCT.
C/ Madre de Dios 51. 26006 Logroño. Tfno. 941 29 9. [email protected]
MATERIAL Y METODOS
INTRODUCCION
A lo largo de su evolución, las levaduras enológicas han desarrollado mecanismos de
adaptación a distintas condiciones ambientales de estrés, manteniendo su integridad
celular y su actividad metabólica durante todo el proceso fermentativo. Pero la
pregunta es como estos organismo alteran su genoma en respuesta a la presión
selectiva de su medio ambiente.
Dado que las condiciones ambientales, en concreto la composición del medio de
cultivo, sufren importantes cambios a lo largo de la fermentación, éstas adaptaciones
responden a diferentes factores y pueden ser distintas en función de la etapa del
proceso que se considere.
Cepas enológicas diferentes pueden mostrar rasgos adaptativos óptimos para
diferentes momentos del proceso. Esto puede explicar en parte la sucesión de cepas
de Saccharomyces cerevisiae que tiene lugar en las fermentaciones espontáneas de
La cepa de estudio es una cepa de laboratorio de la especie Saccharomyces
cerevisiae derivada de S288C, BY4741. Esta levadura fué sometida a un cultivo
continuo emulando las condiciones de la fase de crecimiento exponencial durante
una vinificación. El cultivo contino se realizo a una D= 0,20 h-1 en un mosto sintético
con un 20 % de azucares, suplementado para los requerimientos de la cepa. El
ensayo se realizo por triplicado, llegando a obtenerse poblaciones de entre 150-230
generaciones.
EVALUACION FENOTIPICA
De cada evolución se eligieron 36 cepas al azar. Se realizaron ensayos de
nefelometria en mosto para comprobar el crecimiento de la mutantes respecto a la wild
type. Se eligieron 4 cepas y se determinó su tasa de crecimiento y la cinética inicial
de ferementación. La perdida de CO2 se midió como perdida de peso cada 24 horas.
El crecimiento celular se monitorizó a 600 nm en un lector de microplacas
SPECTROstar Omega instrument (BMG Labtech, Offenburg, Germany). Para cada
cepa se realizaron 8 repeticiones; para estudiar los parametros de crecimiento se
utilizó la ecuacion de Gompertz propuesta por Zwietring et al (1990).
EVALUACION GENOTIPICA
El DNA de cuatro cepas de las tres evoluciones dirigidas y el wild type fue
secuenciado y comparado mediante alineamiento global.
mosto de uva (Querol et al., 1992).
La extracción y purficación del DNA se realizo con un Kit DNeasy plant Minikit
(Quiagen).La secuenciacion se realizó con por el método de terminadores reversibles
con la plataforma Illumina de Solexa.
RESULTADOS
De cada evolución se eligieron 36 cepas al azar, estas fueron analizadas por turbidometria en un nefelómetro para medir el crecimiento de estas respecto a la wild type.
Se seleccionaron 4 cepas que se vieron mejoradas respecto a este en las primeras horas de crecimiento, como se puede ver en el ejemplo para la selección de una de las
evoluciones,Fig 1 y para las cepas seleccionasdas Fig 2.
NTUs
200
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Subconjunto
150
muestra
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Scheffe(a,b,c)
Subconjunto
N
muestra
N
1
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BV 19
8
2,9206
0,2254
BY 4741
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3,2379
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0,2569
AV 8
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E18
8
0,2760
E18
8
4,1253
4,1253
AV 16
8
0,2779
AV 16
8
0,3433
Significación
1
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BY 4741
8
0,1683
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Scheffe(a,b,c)
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BY4741-1
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tiempo (horas)
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Significación
AV-16
Fig 1. Nefelometria
0,2041
0,0546
Tablas 1y 2. Compraciones multiples mediante el test de Scheffe de los valores de µ y lag.
Resultados preliminares indican que la adaptación a esta primera fase no supone, más
bien al contrario, un acortamiento del tiempo total de fermentación (Fig 2). Siendo
posiblemente una adaptación a solo las primeras horas, entendiendose esto como una
mejora durante la fase exponencial, pero no durante el resto de la fermentación.
perdida de peso/volumen (g/ml)
0,2614
4,9575
0,07
0,06
Los datos obtenidos en el lector de microplacas fueron ajustados a un modelo
primario de crecimiento mediante la ecuacion de Gompertz utilizando la
regresión no lineal. Estos datos fueron analizados mediante un test ANOVA y
comparados mediante el test de Scheffe Los valores de la asintota superior (A)
no mostraban homogeneidad de varianzadas por lo que no fueron analizados.
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tiem po (días)
By4741-1
By4741-2
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E18-1
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BV19-1
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BV19-3
Tanto la tasa de crecimiento (mu= (lnx1-lnx0)/dt ), como la lag fueron
significativos para un intervalo de confianza del 95% (P= 0.000 y P= 0.001
respectivamente). El test de comparaciones multiples reveló diferencias
significativas entre la cepa wild type y tres de las cepas evolucionadas para la
tasa de crecimiento y entre la wild type y una de las cepas evolucionadas para la
fase lag. Tablas 1 y 2.
Fig 2. Perfiles fermetativos
CONCLUSIONES
En cada uno de los procesos ha sido posible obtener varias cepas mejoradas respecto a la original en cuanto a su capacidad de crecimiento inicial en mosto modelo, tal como
se ha determinado por su tasa de crecimiento y la cinética inicial de fermentación.
Querol, A., Barrio, E., Huerta, T., Ramón, D. 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58:2948-2953.
Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., & Van't Riet, K. 1990. Appl. Environ. Microbiol., 56(6), 1875-1881.
AGRADECIMIENTOS:
Este trabajo ha sido financiado por el MICINN, proyecto AGL2009-07327.
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