Concentración de
Clorofila-a
Métodos de Medición

La clorofila fue descubierta en 1817 por los químicos franceses
Pelletier y Caventou, que consiguieron aislarla de las hojas de las
plantas. Pelletier introdujo los métodos, basados en la utilización de
solventes suaves, que permitieron por primera vez aislar no sólo la
clorofila, sino sustancias de gran importancia farmacológica como la
cafeína o la quinina.
Es considerada el indicador universal de biomasa fitoplanctonica.

METODOS DE MEDICION

• Espectrofotometria
• Fluorometria
Parsons & Strickland,1963
UNESCO, 1966
Lorenzen, 1967
Jeffrey & Humphrey, 1975
Holm-Hansen et al., 1965
• HPLC (Cromatografía)
1970’s – 1980’s
Mantoura & Llewellyn, 1983
Wright & Shearer, 1984
Revision: Jeffrey, Mantoura & Wright, 1997. Pigments in oceanography.
UNESCO.
Base de los Métodos:
• Filtrado de un volumen conocido
• Reserva del Filtro en sobre de papel aluminio y en N2 Liquido
(Congelador por no mas de 30 dias).
• Pre-preparado del filtro (opcional)
• Extracción de la clorofila-a usando un solvente (Acetona 90%, 100%,
Metanol, …) también en un volumen conocido.
• Centrifugación del extracto
• Lectura del Extracto (Espectrofotómetro/Fluorometro)
Muestra
Solvente
CENTRIFUGA
PREPARACION DEL FILTRO
 Colocar directamente en extracción
 Destruir el filtro usando un bastón de vidrio (Grinding)
 Sonicador
Clorofila-a






Pigmentos de color verde
Espectro de absorcion con dos
picos centrados a 440 nm y 675
nm (depende in vivo, solvente).
Estructura molecular con anillo
de profirina con liga doble, ion
Mg y cadena de Fitol.
Existen tres tipos principales: a,
b y c (divinil-chl-a, -b, chl-c1, c2, -c3).
Presentan Fluorescencia (máx. a
680 nm)
Fotoquímica y captura de luz.
Absorción y Fluorescencia semejantes
a la Clorofila-a
Consecuencias en las lecturas en
Espectro y Fluorimetro
TIPOS DE FILTROS
SOLVENTES
 Acetona 90%
-
se le agrega el 10% de agua para disminuir la “flamabilidad”
- Eficiente y el mas utilizado
- En HPLC no se recomienda al 90% por formación de clorofilase.

Metanol
- mas eficiente que acetona para muchas algas verdes y cianobacterias, pero esto
puede variar con la especie.




Dimetil Sulfoxido (DMSO) – toxico (algas mas resistentes)
Dimetil Formamida (DMF) – toxico (algas mas resistentes)
Dimetil Acetamide – hay pocas pruebas
Etanol – Muy utilizado en fito de agua duclce.
Jeffrey et al., 1997
Espectrofotómetros
1 – 5 cm
Acetona 90%:
664 nm
0.2
0.18
0.16
0.14
DO
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
600
610
620
630
640
650
660
lo n g itu d d e o n d a (n m )
670
680
690
700
 Modificación para corregir feopigmentos (Lorenzen, 1967):
Acetona 90%:
664 nm
0.2
665 nm
647 nm
0.15
DO
630 nm
0.1
0.05
0
600 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 750
antes
despues
Ecuación Final
Chla ( mg .m
3
)
C e .V ace ( mL )
V mue ( L ). cubeta ( cm )
Fluorescencia
y
Fluorometros
Principio:
- Excitación de la clorofila por luz Azul (~ 436 nm)
- Emisión de Fluorescencia en Rojo (685 nm)
Ventajas del Método
2 a 3 ordenes de magnitud mas
sensible que espectrofotometria
 Chla < 0.1 mg.L-1
 Mas de 30 anos de uso (HolmHansen et al, 1965).

Desventajas:
Problema de los Feopigmentos
Presencia de Clb
Aun así, su uso se expande pque
se creía que en aguas oceánicas
no había especies con cl-b
Lámparas de Excitación/Emisión mas usadas
+ usuales
Propuesta de
Welshmeyer, 1994
(Turner 10-AU)
Recomendación: No usar el método de acidificacion cuando se sabe que las
aguas contienen significativa concentracion de clb (aguas dulces o marinas
dominadas por clorofitas o prasinofitas) – Jeffrey et al, 1997
Welshmeyer, 1994
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