ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES MÉTODOS DE METILACIÓN PARA LA
DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS DE LÍPIDOS LÁCTEOS
A. García-Serrano, M.P. Castro-Gómez, M.V. Calvo, L.M. Rodríguez-Alcalá, J. Fontecha
Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación CIAL (CSIC-UAM). C/Nicolás Cabrera 9, Universidad Autónoma de Madrid, 28049 Madrid, España.
La determinación de la composición en ácidos grasos de la leche es muy compleja por su enorme variedad de compuestos lipídicos (triglicéridos (TG), ácidos
grasos libres (AGL), colesterol (C), lípidos polares (LP), etc.), así como por su diferencia en cuanto a longitud de cadena (C4-C26), su ramificación, y sus
isómeros posicionales y geométricos de ácidos grasos insaturados. Debido a las numerosas actividades biológicas que ejercen estos compuestos tras su
ingesta y a su potencial empleo como ingredientes funcionales, es importante realizar un análisis completo de su composición cuali- y cuantitativa.
El objetivo del presente estudio es determinar el método de metilación más adecuado para muestras lácteas en función de su perfil lipídico.
Se utilizaron dos muestras de referencia: mantequilla anhidra (MA), con perfil lipídico neutro; y mazada (Mz), con alto contenido en LP (aprox. 30%). Ambas se
metilaron por tres métodos diferentes y se analizaron mediante 1) HPLC-ELSD (Fig 1), para obtener el porcentaje de metilación de cada clase lipídica y 2) GCFID, para la obtención del perfil de ésteres metílicos (FAME).
Los métodos de metilación utilizados fueron: 1) Método directo ácido-básico desarrollado por nuestro grupo (MeONa-H2SO4) [1]; 2) Método directo básico
desarrollado por Golay y col., (MeONa) [2]; y 3) Método oficial de metilación básica ISO IDF-2002, con necesidad de extracción previa de la fracción grasa
(KOH) [3].
% metilación clases lipídicas Mz
FE
Mz
FS
TG
FC
350
300
DG
250
200
FI
AGL + C
Glucer
Laccer
AF
EM
150
100
MG
Los resultados observados del estudio comparativo demostraron
diferencias entre los métodos de metilación en función de la
composición lipídica de la muestra.
Los tres métodos analizados mediante HPLC-ELSD resultaron ser
igual de eficaces al obtener una metilación completa en el caso
de la MA. Sin embargo, en Mz se obtuvo una derivatización
mayor con los métodos directos MeONa-H2SO4 y MeONa en las
clases lipídicas AGL+C, monoglicérido (MG), diglicérido (DG),
glucosil- y lactosilceramida (Glucer, Laccer) y esfingomielina
(EM), en comparación con KOH (Fig 2).
El análisis de la composición de FAME mediante GC-FID, no
mostró diferencias entre los tres métodos de metilación en MA.
Sin embargo, en Mz (Fig 3) se obtuvo diferente proporción de
FAME en función del método empleado debido a la mayor
heterogeneidad de clases lipídicas.
MA
TG
400
FL
mAU
50
5
10
15
20
25
30
35
40
min
Figura 1. Perfil de clases lipídicas en MA y Mz mediante HPLC-ELSD. AF (ácido fosfatídico), FL (fosfolípidos), FE
(fosfatidiletanolamina), FI (fosfatidilinositol), FS (fosfatidilserina), FC (fosfatidilcolina).
Perfil FAME Mz
30.00
100,00
25.00
80,00
20.00
60,00
15.00
40,00
10.00
5.00
20,00
0.00
0,00
TG
AGL+C
MG+DG
MeONa:H2SO4
Glucer
MeONa
LacCer
FP
EM
C4
KOH
Figura 2. Porcentaje de metilación de las clases lipídicas obtenido en Mz
mediante los tres métodos empleados. Análisis mediante HPLC-ELSD.
C6
C10
C12
C14
C16
MeONa-H2SO4
C16:1 c9
MeONa
C18
C18:1 C18:1 c9 C18:2
t11
c9; 12
KOH
Figura 3. Porcentaje de los principales FAME (1%≥ total) obtenidos en Mz mediante los tres métodos de
metilación. Análsis mediante GC-FID
- Los métodos directos MeONa-H2SO4 y MeONa fueron los más eficaces para
muestras lácteas con presencia predominante de LP (Mz).
- Todos los métodos fueron efectivos para muestras lácteas con un perfil lipídico
neutro (MA). No obstante, MeONa-H2SO4 y MeONa serían los idóneos en
matrices complejas al no requerir la extracción previa de la fracción lipídica de
la muestra.
[1] P. Castro-Gómez, J. Fontecha, L. M. Rodríguez-Alcalá (2014) A high performance direct
transmethylation method for total fatty acids assessment in biological and foodstuff
samples, Talanta, accepted.
[2] P-A Golay, F. Dionisi, B. Hug, F. Giuffrida, F. Destaillts (2006) Direct quantification of fatty
acids in dairy powders with special emphasis on trans fatty acid content, Food Chemistry
1115-1120.
[3] ISO IDF- 2002. Milk fat-Preparation of fatty acid methyl esters. ISO 15884-IDF:182:2002.
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