Alteraciones citoesqueletales y
nucleares en células tumorales de
pulmón: un estudio de microscopio
confocal
Renata Manelli-Oliveira, Gláucia Maria Machado-Santelli
Objetivo
➣
Caracterizar los filamentos del citoesqueleto
➣ Analizar si existe una asociación entre
alteraciones nucleares y en el citoesqueleto en
células de pulmones humanos con carcinoma
Introducción
Citoesqueleto: Tres tipos de filamentos
Filamentos intermedios
Microfilamentos de actina
Microtúbulos
Juegan un rol importante en la organización del núcleo durante la mitosis.
Introducción
Vimentina: Filamento intermedio
Se expresa en células mesenquimáticas, como
fibroblastos.
Función asociada a morfología nuclear y membrana
nuclear en mitosis:
● sin vimentina o con una forma mutada el núcleo
presenta deformaciones
● no se ven alteraciones citoplasmáticas en estas
células
La expresión de vimentina así como la organización de los
filamentos de vimentina son factores importantes en la morfología
del núcleo.
Introducción
La queratina en ratones y humanos es crucial para
mantener la integridad y las conexiones requeridas para
distintos tejidos epiteliales.
Coexpresión de vimentina
y queratina asociada a morfología
migratoria, presente en células
tumorales y relacionada con el
potencial de desarrollar metástasis.
Introducción
Laminas
Filamento intermedio que en la interfase
interactúa con la cromatina y la membrana
interna nuclear (MIN)
Asociadas a la ruptura de la membrana
nuclear durante la mitosis:
Lamina A
Lamina B
Disociada completamente de la MIN
Disociada pero en asociada a la proteína
p58 y se reensambla al final de la mitosis
Introducción
Microtúbulos y microfilamentos de actina
Implicados en la reestructuración de la célula durante la
mitosis
Estudiados como target de drogas antitumorales:
Si se inhibe su polimerización (ej. colchicina) se afecta la
proliferación de las células.
Materiales y métodos
Cultivos celulares:
➢ Línea HK1: células humanas de carcinoma de pulmón (realizada In
vitro de una metástasis cervical).
➢ Línea HK2: células de un tumor inducido en ratones atímicos
“nude” (derivadas de las HK1).
➢ A549: línea celular de carcinoma de pulmón.
➢ BRL3A: células epiteliales normales de hígado de ratón (control).
Materiales y métodos
Inmunofluorescencia (análisis del citoesqueleto)
➢ Líneas celulares: HK2, A549, BRL3A.
➢ Anticuerpo primario: α-tubulina, vimentin, laminB, cytokeratin peptide 8.
➢ Anticuerpo secundario: anti IgG-FITC (raton), anti IgG-FITC (cabra).
➢ Núcleo : SYTOX green, TOTO1.
➢ Filamentos de Actina: phalloidin-TritC.
Materiales y métodos
Análisis por microscopía confocal:
➢El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz
reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de
foco.
➢Para ello se ilumina una pequeña zona de la muestra y se toma
el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminándose los
haces procedentes de los planos inferiores y superiores.
Materiales y métodos
Análisis por microscopía confocal:
Materiales y métodos
Análisis por microscopía confocal:
Ventajas:
➢ Permite una mejor resolución de la imagen debido a que
elimina la señal de fluorescencia que se encuentra fuera de
foco, que disminuye el contraste de la muestra.
➢ Se obtienen distintas secciones de la muestra de forma no
destructiva.
➢ Análisis tridimensional, cuantificación, distribución de
fluorescencia, análisis volumétrico de la colocalización, etc.
Materiales y métodos
Alteraciones nucleares:
➣ Alteraciones en el micronúcleo
Estructura formada por cromatina dentro de una envoltura nuclear, siendo ésta
más pequeña que el núcleo principal. Se observan como protuberancias bien
definidas sobre la superficie nuclear
➣ Alteraciones nucleares incipientes
RESULTADOS
Discusión
➣ El plateau de la curva de crecimiento sugiere que las células HK2
mantienen una densidad de saturación, al igual que las células normales a
pesar de la presencia de células gigantes.
➣ HK2 y A549 no muestran una fase típica en su plateau.
➣Los filamentos intermedios no son confiables para identificar células
tumorales y distintos tipos celulares en un diagnóstico ya que en ellas se
pueden coexpresar dos tipos de filamentos.
➣ En células HK2 la actina mostró un patrón de fibras cortas agregadas en el
citoplasma, consistente con una morfología celular irregular en células
tumorales y con alteraciones en la movilidad celular.
Las alteraciones observadas en el núcleo no estan asociadas a las anomalías en la
distribución de los filamentos del citoesqueleto.
Discusión
➣El patrón de distribución de filamentos de vimentina en este estudio
concuerda con otros observados en trabajos previos en cultivos de células
endoteliales.
➣Las fibras de stress, características de este tipo de filamentos, se vieron en las
dos líneas estudiadas y BRL3A (control) presentó más que las líneas tumorales.
➣Organización del tipo de actina fue más evidente en HK2, siendo consistente
con una morfología celular más irregular. Cómo este patrón se encontró en
células tumorales se sugiere que la transformación produce alteraciones en
estos filamentos y podrían estar asociados a la movilidad celular.
➣La organización espacial de las fibras de stress en A549 fue más similar a las de
BRL3A que a las de células normales de hígado de rata.
Discusión
➣En las células gigantes de HK2 los filamentos son más evidentes y
presentan patrones radiales. Estos patrones se encontraron al marcar
filamentos de tubulina a concentraciones altas y bajas de calcio.
La concentración de calcio en el medio de cultivo afectaría la organización
de los microtúbulos en células no transformadas.
➣La presencia de lámina B, en este y otros estudios, resultó indicadora de la
integridad de la envoltura nuclear.
Podría utilizarse para la clasificación de alteraciones nucleares si involucran la
totalidad de la membrana nuclear, como se vió con HK2 y A549.
Resumiendo
➣El estudio en las líneas HK2 y A549 permitió caracterizar el patrón de
organización de los filamentos del citoesqueleto.
El citoesqueleto en HK2 está alterado en comparación a A549
➣Las alteraciones micronucleares y nucleares no se pudieron asociar a las
del citoesqueleto.
➣La distribución de los patrones de los filamentos del citoesqueleto
citoplasmático fue similar para células con o sin alteraciones nucleares.
➣Se verificó la coexpresión de vimentina y citoqueratina 8 que sucede en
diversas células tumorales.
Estas caracterizaciones son de importancia para estudios
futuros en particular en estudios sobre la acción de drogas.
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