Raúl Gil Orts
MIR 2 Análisis Clínicos
INDICE
 INTRODUCCIÓN
 TINCIONES
 CULTIVOS
 TÉCNICAS DIRECTAS
 MÉTODOS MOLECULARES
 MALDI-TOF
 TÉCNICAS FUTURAS
INTRODUCCIÓN
-Procesos manuales
-Pruebas que se realizan directamente en la muestra y permiten
detectar la presencia de microorganismos o de fragmentos de los
mismos en las muestras.
- Técnicas aplicadas a procesos habituales que permiten acortar de
manera significativa el tiempo necesario para facilitar el resultado
- Especialmente útiles cuando el agente causal crece lentamente o no
crece en los medios de cultivo.
- Los resultados no se ven alterados por la administración previa de
antimicrobianos.
- Inconveniente: no ofrece información sobre la sensibilidad a los
antimicrobianos
TINCIÓN
-Se realizan sobre la muestra obtenida y procesada adecuadamente
- Morfología microscópica y características tintoriales
Tinción
Aplicación
Resultados
Comentarios
Gram
Diagnóstico
presuntivo, sobre
todo en neumonía
y meningitis
bacteriana
Deteccíón de
leucocitos,
reconocimiento de
la morfología de
bacterias comunes
Requiere
experiencia;
Puede diferenciar
levaduras
Azul de metileno
Gránulos
metacromáticos
de corinebacterias
Morfología general Corynebacterium
y seleccionada
diphteriae
Wright-Giemsa
LBA,
preparaciones de
Tzanck, muestras
con fondo celular
complejo
Morfología general Permite visualizar
de las estructuras
bacterias,
celulares
levaduras,
parásitos e
inclusiones virales
Tinción
Tinción
Aplicación
Resultados
Comentarios
Ziehl-Neelsen
Kinyoun
Muestras (ESP, LBA,
LCR, orina, etc)
para identificar
BAAR y diferenciar
de actinomicetales
BAAR muestran un
color rojo granate,
sobre fondo azul,
permite detectar
también parásitos
como
Cryptosporidium y
Ciclospora
Las micobacterias
son bacilos rectos,
cortos o largos y las
nocardias son
bacilos
arboriformes y
ramificados
Microscopía de
campo oscuro
Examen directo de
lesiones con
sospecha de sífilis
primaria
Se ven
espiroquetas
móviles
Requiere
experiencia
Tinta china
Examen directo de
la extensión de
LCR, sangre y orina
para Crytococcus
Cryptococcus
posee una cápsula
de polisacáridos
que aparece
como un halo
sobre un fondo
oscuro
Tinción inversa, la
cápsula no se tiñe;
requiere
experiencia para
diferenciar
leucocitos de
levaduras
Tinción
Tinción
Aplicación
Resultados
comentarios
KOH 10%
Examen directo de
las extensiones de
piel, pelos y uñas
para ver
dermatofitos
Visualiza
elementos
fúngicos
Digiere las proteínas
de las muestras y
facilita la visualización
Blanco Calcoflúor
Examen LCR, LBA y
otros líquidos
corporales para
detectar
estructuras
fúngicas y algunos
quistes parasitarios
Las levaduras y
mohos
muestran una
fluorescencia
blanquecina
suave
Tinción fluorescente
que se fija a la pared
celular de hongos y
levaduras, pero no a
bacterias o células
inflamatorias.
Requiere M. Fluoresc.
Auraminarodamina
Útil para la
búsqueda de BAAR
en una variedad
de muestras
clínicas.
Extensiones
concentradas
de sedimentos
de
micobacterias
Tinción preferida para
BAAR, por su
rendimiento en el
cribado de gran
número de muestras
Requiere M. Fluoresc.
TINCIÓN
GRAM
neumococo
TINCIÓN
GRAM
LCR: Neisseria meningitidis
Exudado uretral:
Neisseria gonorrea
TINCIÓN
Blanco calcoflúor
Candida albicans
TINCIÓN
Auramina
Zhiel-Neelssen
TINCIÓN
Tinta China
Cryptococcus neoformans
CULTIVOS BACTERIANOS
Nivel Hemocultivos
- Forma tradicional
- Incubación frascos hemocultivos. (8-24 horas)
- Tinción de Gram y cultivo en medios sólidos + ATB (24-48h)
- Técnica rápida
- Procesar directamente la sangre del frasco hemocultivo
Extraer 10 ml
de sangre
IDENTIFICACIÓN - 3-4h
ANTIBIOGRAMA – 6-12h
Centrifugar
1500 rpm
5 min
SEDIMENTO
- LIQUIDO ASCÍTICO, L. ARTICULAR, L. PLEURAL
Centrifugar
3 ml sobrenadante
Repartidos 2 tubos
Eppendorf
13000 rpm
1 min
TÉCNICAS DIRECTAS
-Técnicas diagnósticas que se aplican directamente en una muestra
patológica (orina, sangre, frotis nasofaríngeos, heces, LCR)
- mínima manipulación
- reducen el tiempo del proceso analítico
-También denominadas “point-of -care test“
-Beneficio:
-Permiten administrar el tratamiento adecuado en el menor
tiempo
mejor evolución enfermedad
-técnicas :
-Inmunocromatografía
-Enzimoinmunoanálisis
-Inmunofluoerescencia indirecta
- PCR a tiempo real
TÉCNICAS DIRECTAS
Test/Microorganismo
Muestra
Técnica
S
E
Antígeno neumococo
Orina, LCR, LPL
ICT
66-70
90-100
Antígeno legionella
Orina
ICT
76
99
Plasmodium
Sangre
ICT
87-100 52-100
S. pyogenes
Frotis faríngeo
EIA
53-99
62-100
Antígeno VRS
Frotis nasofaríngeo
ICT
59-97
75-100
Antígeno rotavirus
Heces
ICT
75-99
95
S. aureus (MRSA)
S. agalactiae
Enterovirus
Frotis nasal
Frotis vaginal
LCR
PCR t.r.
86-94
94-97
97
93-95
96-100
100
VIH
Sangre
ICT
99-100 99-100
TÉCNICAS DIRECTAS
Microorganismo
Muestra
Técnica
Haemophilus influenzae
Muestra respiratoria
Líquido pleural
LA
Virus gripe A y B
Moco nasofaríngeo
Exudados nasal y
faríngeo
IFI, ICT, EIA
Metaneumovirus
Moco nasofaríngeo
IFI
Virus parainfluenza 1, 2, 3
Moco nasofaríngeo
IFI
Adenovirus
Moco nasofaríngeo
Exudados nasal y
faríngeo
IFI, ICT
TÉCNICAS DIRECTAS
Antígeno neumococo
Antígeno legionella
Antígeno VRS
Plasmodium
TÉCNICAS DIRECTAS
S. pyogenes
Entamoeba hystolitica
EIA
Rotavirus
Toxina C. difficile
MÉTODOS MOLECULARES
PNA-FISH
- peptide nucleic acid fluorescent in-situ hybridization
- Se emplean cebadores fluorescentes que hibridan con los
pares de bases de nucleótidos contenidos en el ARN ribosomal de los
microorganismos.
- Útil para detectar bacteriemias por S. aureus, E. coli,
Enterococcus spp, Ps. Aruginosa o fungemias por Candida spp. En
aproximadamente 3 horas
Métodos moleculares
PNA-FISH
Ps. aeruginosa
S. aureus
MÉTODOS MOLECULARES
PCR en tiempo real
- Modificación de PCR convencional
- Mejora la rapidez en la detección
- Mejora en Sensibilidad y Especificidad
- Detecta a la vez que amplifica
- Sistema cerrado: evita contaminaciones y pérdida de tiempo con
el empleo de geles agarosa
- Sensibilidad y especificidad igual o superior al 95%
- Tiempo de ejecución 1.5 horas
MÉTODOS MOLECULARES
-PCR a tiempo real
- Test comercializados:
- Detección MRSA en frotis nasales
- Detección Enterococcus spp. resistentes a glucopéptidos en
frotis rectales
- Clostridium difficile en heces
- S. agalactiae en frotis vaginal y rectal en embarazadas
- Enterovirus en LCR
- Cuantificación de citomegalovius, VIH o hepatitis C
MÉTODOS MOLECULARES
PCR t.r.
Detección: - S. aureus resistente a meticilina
- Clostridium difficile
- Enterovirus en LCR
- S. agalactiae
MALDI-TOF
- Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight
- Se describió hace 30 años
-Se diseñó para analizar biomoléculas
- uso reciente para la identificación de microorganismos
-Técnica:
- Se emplea un emisor de rayos láser que se aplica a una mezcla
del microorganismo y una matriz que absorbe la mayoría de la
energía emitida
- las proteínas del microorganismo quedan ionizadas y son
sometidas a una aceleración en un campo eléctrico
- son separadas según masa y carga hasta que llegan a un
detector
- el perfil de proteínas generado se compara con una base de
datos y en menos de 10 min. se dispone de la identificación
MALDI-TOF
Ventajas:
- Rapidez
- más barato que sistemas habituales
- puede identificar la mayoría de microorganismos habituales
Uso:
-para identificar bacterias y levaduras a partir de colonias
- puede utilizarse en frascos de hemocultivos positivos
- puede detectar proteínas concretas
- proteína fijadora de penicilina PBP2a identificando así
staphylcoccus resistentes a oxacilina.
Técnicas futuras
Multiplex PCR tiempo real
Técnica Septifast de Roche.
Desarrollada para identificar a partir de sangre del paciente con
sospecha de bacteriemia o candidemia hasta 25 microorganismos
frecuentes.
Aún no comercializado
Secuencición del ADN: pirosecuenciación
Método rápido que se fundamenta en la detección del pirofosfato
liberado durante la síntesis de ADN
Permite detectar el polimorfismo de un solo nucleótido se ha empleado:
- genotipado de bacerias y virus
- reconocer mutaciones de resistencia a antivíricos en VIH
- caracterizar bacterias resistentes a antibióticos
Técnicas futuras
Sistema StaphPlex
Diseñado para detectar y amplificar 18 genes de forma simultánea que
permiten identificar :
-a nivel de especie diferentes estafilococos
- identificar resistencia a antibióticos más utilizados
GRACIAS
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PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO EN MICROBIOLOGÍA