BIOTECNOLOGIA
AMBIENTAL
Biorremediación
Monitoreo
Control de la
ambiental
polución
AGROPECUARIO
MEDICINA
APLICACIONES
UTILES
Diagnóstico
Rendimiento de
Calidad de
cosechas
alimentos
Salud animal
Biosensores
Bioprocesos
Vacunas
Terapéutica
Cultivo de células y
tejidos
Ingeniería genética
HERRAMIENTAS BIOTECNOLOGICAS
Antisentido
Anticuerpos monoclonales
Ingeniería de proteínas
Bioquímica
Ingeniería
Bioquímica
Microbiología
Biología Celular
Inmunología
CONOCIMIENTO
Computación
CIENTIFICO
Biología Molecular
Genética
Fisiología
Nos encontramos frente a
una nueva “Revolución
Industrial” llamada
Biotecnología, no basada en
hierro y acero sino en
microbios que, en manos de
científicos, se convierten en
minúsculas fábricas para
producir fármacos,
compuestos químicos
industriales, combustibles o
alimentos.
El prefijo “BIO” se refiere a
bacterias, levaduras y otras
células vivas, así como a
componentes de estas
células.
La “TECNOLOGIA”
consiste en relucientes
depósitos de acero, llenos de
microbios, conectados a sus
fuentes de alimentación y
oxígeno mediante una
intrincada red de válvulas
que se cierran y abren según
los ritmos que marca una
computadora.
DEFINICION
Según la Organización de
Cooperación y Desarrollo
Económicos:
Es la aplicación de los
principios científicos y de la
ingeniería al procesamiento de
materiales por agentes
biológicos para proveer bienes y
servicios.
PRINCIPIOS
CIENTIFICOS Y DE LA
INGENIERIA:
Conjunto muy amplio
de disciplinas que ponen
especial énfasis en la
Microbiología,
Bioquímica, Biología
Molecular, Genética,
Inmunología e
Ingeniería Bioquímica y
Química.
MATERIALES:
Incluye a aquellos
orgánicos e
inorgánicos, en tanto
los agentes biológicos
son, en general,
catalizadores
biológicos; en
particular,
microorganismos,
células animales,
células vegetales, virus
y enzimas.
BIENES:
Todos los productos
(alimentos, productos
farmacéuticos, recuperación
de metales, etc.)
SERVICIOS:
Lo relacionado
específicamente con las
prestaciones tales como
purificación de agua o
tratamiento de efluentes y
extracción de derrames de
petróleo.
AREAS TEMATICAS
PRIORITARIAS
SALUD:
Vacunas (desarrollo de
vacunas por procedimientos
que utilicen ingeniería
genética).
Reactivos de diagnóstico:
Desarrollo de reactivos por
técnicas inmunológicas
(enzimo-inmunoensayos o
por ingeniería genética).
AREA AGRICOLA:
Diagnóstico de fitopatógenos en plantas
de interés económico.
Desarrollo de agentes de control biológico
y plantas.
Desarrollo de plantas transgénicas
resistentes a las plagas, enfermedades y
herbicidas. Modificación del contenido
celular en macromoléculas.
Métodos de mejoramiento de especies a
través de técnicas no convencionales.
Aceleración en la obtención de híbridos.
Utilización de marcadores moleculares.
Identificación y caracterización de genes
de interés.
AREA PECUARIA:
SANIDAD ANIMAL:
Desarrollo de métodos para
el diagnóstico de
enfermedades animales.
Producción de nuevas
vacunas virales, bacterianas
y parasitarias por técnicas de
avanzada.
PRODUCCION ANIMAL:
Manipulación y sexado de
embriones.
Hormonas para el
mejoramiento de la
producción animal.
PRODUCCION DE
INSUMOS
INDUSTRIALES:
Mejoramiento y control
de calidad de las industrias
de alimentos, incluyendo
derivados lácteos, vinos y
cervezas.
Tratamiento biológico de
efluentes.
HISTORIA DE LA
BIOTECNOLOGIA
•6000 AC: Arte de fermentar.
Los sumerios y babilonios
usaban levaduras para
fabricar cerveza.
•4000 AC: Los egipcios
descubrieron la manera de
fermentar pan con la
levadura cervecera.
•Libro del Génesis (9:
20,21): “Noé se dedicó a la
labranza y plantó una viña.
Bebió del vino, se
embriagó…”
•Siglo XIV DC: Destilación de
bebidas alcohólicas. Uso de
bacterias de ácido acético para
fabricar vinagre, de bacterias de
ácido láctico para conservar la
leche (yogur, por ejemplo).
•Siglo XVII: Anthony von
Leeuwenhoek (1632-1723)
descubre el mundo microbiano
con sus microscopios primitivos.
•Siglo XIX: El desarrollo
técnico de los microscopios
permite demostrar el origen de
los microbios y vencer la
creencia de la “generación
espontánea”.
Hablando de “generación
espontánea”, veamos
algunas recetas
interesantes…
Ambroise Paré (1517-1590), el
más célebre cirujano de su
siglo, escribe: “Hallándome en
una viña de mi propiedad,
próxima al pueblo de Meudon,
hice romper una enorme
cantidad de grandes piedras
sólidas. Dentro de una de ellas
se encontró un grueso sapo
vivo, sin que hubiera en la
piedra la menor apariencia de
abertura…
…Me maravilló el hecho de
que este animal hubiese
podido nacer, crecer y vivir
allí. Pero el cantero me dijo
que no había por qué
asombrarse, pues varias veces
había hallado animales de ésta
y de otras clases en lo más
recóndito de las piedras, sin
que existiese el menor indicio
de una abertura. Se puede
explicar así el nacimiento y la
vida de estos animales: son
engendrados a partir de alguna
sustancia húmeda de las
piedras, cuya humedad, al
entrar en putrefacción,
produce tales seres.”
Van Helmont (1577-1644), el
más grande fisiólogo de la época,
indica lo siguiente para la
obtención de ratones: un vaso
lleno de trigo se cubre con una
camisa sucia, preferentemente de
mujer. “Un fermento originado en
la camisa y transformado por el
olor de los granos, convierte el
trigo mismo en ratones.” Esta
metamorfosis dura cerca de
veintiún días, o sea el tiempo de
gestación de ratón y nuestro
naturalista se asombre de su
notable rapidez…
…”Ello, nos dice, es tanto
más admirable cuanto que los
ratones originados por el trigo
y la camisa no son pequeños
ni lactantes, ni minúsculos, ni
deformes, sino muy bien
formados y pueden saltar.”
•Francesco Redi (1626-1697):
Médico italiano que demostró
que los gusanos de la carne son
larvas de mosca y que no
aparecen si la carne se guarda
bien tapada (“fiambrera”).
•Lázaro Spallanzani (17291799): Naturalista italiano,
demostró que los microbios
son transportados por el aire;
los mismos no invaden los
frascos cerrados
herméticamente.
•Nicolas-Francois Appert (17501841): Desarrolla los primeros
procedimientos de enlatado.
•Louis Pasteur (1822-1895): Fue
quien sentó las bases de la futura
industria biotecnológica al
demostrar que todos los procesos
de fermentación eran el resultado
de la actividad microbiana.
•Edward Buchner (1860-1917):
Descubre, dentro de las células
microbianas, las sustancias
vitales responsables de todas las
transformaciones químicas: las
enzimas.
Hasta la primera guerra
mundial, apenas progresó la
idea de utilizar bacterias y
levaduras para fabricar otra
cosa que no fuera alcohol.
Sin embargo, las restricciones
impuestas durante el conflicto
anunciaron lo que puede
llamarse como “segunda era
biotecnológica.”
•La Guerra Mundial (1914-1918)
supuso demandas
biotecnológicas:
•Proceso Neuberg para
producir glicerol (para
nitroglicerina) mediante la
“fermentación dirigida” de
Saccharomyces cerevisiae.
Agregando álcali y bisulfito de
sodio al depósito de
fermentación alcohólica se
fomentaba la producción de
glicerol.
•Proceso Weizmann, usando
Clostridium acetobutylicum,
para la producción de
disolventes como la acetona
(fabricación de cordita).
•Los descubrimientos de
Pasteur, Robert Koch (18431910) y Alexander Fleming
(1928) revolucionaron el
tratamiento de las
enfermedades infecciosas con
el descubrimiento de los
antibióticos.
•Durante la Segunda Guerra
Mundial comienza la tercera
era biotecnológica, por la
necesidad de contar con
ciertos medicamentos para
que las víctimas no murieran
de sepsis bacteriana.
Puede decirse que la “cuarta era
biotecnológica” comienza a
principios de la década de 1970,
con el advenimiento de la
Ingeniería Genética.
•El descubrimiento de los
sistemas de restricción y
modificación en bacterias y la
aplicación de las
endonucleasas.
•Los trabajos de Milstein y
Kohler sobre la formación de
hibridomas con la posterior
utilización para la producción
de anticuerpos monoclonales
(1975).
Un hito que merece resaltarse
ocurrió en 1982 cuando la
compañía Eli Lilly consiguió
la aprobación de la Food and
Drug Administration de los
Estados Unidos de
Norteamérica para la
utilización de “insulina
humana” clonada y
producida en Escherichia
coli. A esto siguieron los
interferones, hormonas de
crecimiento humana y
bovina, el antígeno de
superficie del virus de la
hepatitis B, etc.
Entrando ya en
tema…
El desarrollo de un proceso
de producción a gran escala,
en forma exitosa, es el
resultado de acelerar e
intensificar un concepto
original, generalmente un
procedimiento de laboratorio
o a pequeña escala.
La actividad de
desarrollo se concentra
en tres áreas principales:
•Desarrollo de los organismos.
•Desarrollo del medio de cultivo.
•Ingeniería de fermentación.
EL FERMENTADOR
DEFINICION OPERATIVA:
•Contenedor en el que se
mantiene un medio ambiente
favorable para la operación de
un proceso biológico deseado.
En cuanto al biorreactor:
Para cada proceso
biotecnológico, el sistema
de contención más
apropiado debe diseñarse
para brindar el mejor medio
ambiente, optimizado para
el crecimiento celular y
actividad metabólica.
Equipos accesorios.
•Válvulas de seguridad
•Manómetros
•Válvulas de control
•Tuberías
•Control de temperatura
•Control de pH
•Control de espumas
•Puntos de muestreo
El medio ambiente puede
considerarse en tres aspectos:
•BIOLOGICO
•QUIMICO
•FISICO
AIREACION Y AGITACION.
La agitación es necesaria para:
1- incrementar la velocidad de
transferencia de oxígeno desde
las burbujas de aire al medio
líquido; los microorganismos
no pueden utilizar oxígeno
gaseoso, sino solamente el que
se encuentra en disolución.
2- aumentar la velocidad de
transferencia de oxígeno y
nutrientes desde el medio a las
células. Debido al movimiento
se evita que las células creen
áreas estancadas con bajos
niveles de oxígeno y
nutrientes.
3- impedir la formación de
agregados celulares.
4- aumentar la velocidad de
transferencia de productos
metabólicos de las células al
medio.
5- aumentar la tasa o la
eficiencia de la transferencia
de calor entre el medio y las
superficies de refrigeración
del fermentador.
Tipos de fermentador:
•Crecimiento en suspensión.
•Crecimiento con soporte.
En el crecimiento en suspensión,
los organismos están sumergidos
y dispersados en el medio
nutritivo y su movimiento sigue al
del medio.
En los sistemas con soporte,los
organismos crecen como una
monocapa o película sobre una
superficie en contacto con un
medio nutritivo.
En la práctica, sin embargo, los
sistemas en suspensión poseen
una película de organismos en la
superficie del contenedor y en
sistemas con soporte,
encontramos organismos
dispersos en el medio nutritivo.
TECNOLOGIA DE
BIOPROCESOS FERMENTACION
Las etapas en la manufactura
de productos en la tecnología
de bioprocesos son,
esencialmente, similares
independientemente del
organismo utilizado, del
medio elegido y del producto
buscado.
En todos los ejemplos, se
cultiva gran número de células
en condiciones controladas.
Los organismos deben
cultivarse y “motivarse” para
formar el producto deseado,
mediante un sistema de
contención técnica y física (el
biorreactor) y un medio
correcto en su composición y
parámetros reguladores del
crecimiento, tales como
temperatura y aireación.
PRINCIPIOS DE
CRECIMIENTO
MICROBIANO
El crecimiento de
microorganismos puede
verse como el incremento
en el material celular,
expresado en términos de
masa o número de células.
El incremento en biomasa
puede determinarse
gravimétricamente o
numéricamente para
sistemas unicelulares.
Tiempo de duplicación:
Se refiere al tiempo
requerido para duplicar el
peso de la biomasa.
Tiempo de generación:
Se refiere al tiempo
necesario para duplicar
el número de células.
En un proceso biotecnológico,
existen tres formas de hacer
crecer a los microorganismos en
un biorreactor:
-Por lotes (batch)
-Semi-continuo
-Continuo
Modos de operación de los
fermentadores:
•Operación por lotes: El
reactor se carga con la especie
reactiva y, a medida que
procede la reacción, cambian
las condiciones en el reactor al
consumirse los reactivos y
formarse los productos.
Cuando se ha alcanzado el
nivel deseado de reacción, se
vacía el reactor, se limpia y el
proceso se repite. Son
procesos que no se encuentran
en estado estacionario.
El ambiente nutricional
dentro del biorreactor
cambia en forma continua y,
por lo tanto, fuerza
cambios en el metabolismo
celular.
Eventualmente, la
multiplicación celular cesa
por desaparición o
limitación de nutrientes y
acumulación de productos
tóxicos de excreción.
La naturaleza compleja del
crecimiento de
microorganismos por lotes,
se muestra tal como sigue:
La fase 1 o “lag”, es un tiempo
de aparente no crecimiento,
pero estudios bioquímicos
demuestran actividad
metabólica, indicando que las
células están en proceso de
adaptación a las condiciones
ambientales y que un nuevo
crecimiento comenzará,
eventualmente.
Existe, luego, una fase de
aceleración transitoria
cuando el inóculo comienza a
crecer que es seguida,
rápidamente, por una fase
de crecimiento exponencial.
En la fase exponencial, el
crecimiento microbiano
ocurre a la máxima
velocidad posible para ese
microorganismo, con
nutrientes en exceso,
parámetros de crecimiento
ideales y ausencia de
inhibidores.
Sin embargo, en cultivos por
lote, el crecimiento
exponencial es de duración
limitada y, a medida que las
condiciones nutricionales
cambian, la velocidad de
crecimiento disminuye y se
entra en la fase de
deceleración, seguida de la
fase estacionaria, donde el
crecimiento global no se
obtiene, por falta de
nutrientes.
La fase final del ciclo es la
fase de muerte, cuando la
velocidad de crecimiento ha
cesado.
La mayoría de los procesos
biotecnológicos por lotes se
detiene antes de esta fase,
debido a la disminución en el
metabolismo y a la lisis
celular.
Algunos medios para prolongar
la vida de un cultivo por lotes:
-Adición gradual de
componentes nutritivos
concentrados (carbohidratos),
aumentando el volumen del
cultivo (utilizado para
producción industrial de
levadura).
-Adición de medio al cultivo
(perfusión) y extracción de un
volumen igual de medio usado,
libre de células (utilizado para
cultivos de células animales).
•Operación continua: Existe
un flujo continuo de reactivos
frescos hacia el reactor y el
producto fluye continuamente
hacia fuera. En algunos
sistemas continuos el medio
nutriente es inoculado con el
cultivo microbiano al entrar al
reactor y los organismos llevan
a cabo su actividad a medida
que el líquido fluye a través del
sistema y salen del sistema
junto con el medio.
Los organismos pueden
separarse de la corriente
que lleva al producto y
reciclarse para inocular el
líquido de alimentación.
En un sistema continuo con
mezcla completa, las
condiciones son uniformes
en todo el reactor, en un
equilibrio de mezcla de
nutrientes, organismos y
productos.
La alimentación del sistema
es medio nutriente libre de
organismos y, en algunos
casos, un inóculo de
organismos reciclados.
Esta práctica de cultivo
continuo, provee un
crecimiento casi
balanceado, con pequeña
fluctuación de nutrientes,
metabolitos, número celular
o biomasa.
Esto consiste en medio
fresco entrando un sistema
por lotes, en fase de
crecimiento exponencial,
con una remoción
correspondiente de medio
más células.
Este método de cultivo
continuo, permite a los
organismos crecer en
condiciones de estado
estacionario, en las que el
crecimiento ocurre a una
velocidad constante y en un
medio ambiente constante.
En un sistema de cultivo
perfectamente mezclado,
se pasa medio estéril al
biorreactor, a un flujo
constante y una mezcla de
cultivo (medio, productos
de desecho y organismos)
emergen del mismo a la
misma velocidad,
manteniendo el volumen
total del cultivo, dentro del
biorreactor, constante.
Ventajas de un proceso
por lotes:
Las principales son: menor
riesgo de contaminación,
flexibilidad operacional
cuando los fermentadores
se utilizan para distintos
productos, un control más
cercano de la estabilidad
genética del organismo, una
mejor coordinación con
estadios del proceso entre
lotes previos y posteriores.
Desventajas del proceso
por lotes:
La principal es la alta
proporción de tiempo
improductivo en la operación
del fermentador, dificultad de
diseño y la operación de
procesos que no están en
estado estacionario y la
variabilidad entre lotes.
Los fermentadores deben
ser vaciados, limpiados,
esterilizados y recargados
antes de cada
fermentación, operaciones
todas esenciales pero no
productivas.
En procesos por lotes,
estas operaciones pueden
tomar tanto tiempo como
la fermentación misma.
En un proceso continuo,
por el contrario, una
corrida puede durar
semanas o meses, es decir
que el tiempo no
productivo es, en
proporción, pequeño.
Esterilización:
•Esterilización de fermentadores.
•En el laboratorio, el método
estándar de esterilización es
el calor: 120ºC de calor
húmedo durante 15 min o
160ºC de calor seco durante,
al menos, 1 hora. A escala
industrial, el calor seco es
prohibitivamente caro, salvo
en casos muy especiales y se
utiliza, habitualmente, la
esterilización por calor
húmedo.
•Esterilización del fermentador y
el medio conjuntamente.
•El calentamiento se
consigue mediante:
•Inyección de vapor en el
medio, por lo que el medio
se prepara ligeramente
más concentrado para
compensar la dilución por
el vapor condensado.
•El medio se calienta por
conducción, haciendo
pasar vapor por la camisa
de termostatización.
•Esterilización por separado del
fermentador y el medio.
•Este sistema ofrece ventajas
ya que reduce el tiempo en el
que el recipiente de
fermentación es
improductivo: un
fermentador vacío se
esteriliza con relativa
rapidez.
Pasos a tener en cuenta:
-Cambio de escala
-Diseño de medios para
procesos de fermentación
-Fermentación en
sustratos sólidos
-Tecnología de cultivos de
células de plantas y
animales
-Procesamiento posterior
de la muestra
Procesamiento
posterior de la
muestra.
Purificación.
El diseño y la operación
eficiente de los procesos de
purificación, son elementos
vitales para obtener los
productos deseados para
uso comercial.
Deberían reflejar la
necesidad de no perder más
que lo absolutamente
necesario del producto
final.
Este procesamiento final
involucrará, principalmente,
la separación inicial de la
mezcla de cultivo hacia una
fase líquida y una sólida, con
la subsecuente
concentración y purificación
del producto deseado.
El procesamiento involucrará
más de una etapa:
-Destilación
-Centrifugación
-Filtración
-Ultrafiltración
-Extracción con solventes
-Adsorción
-Tamices moleculares
-Electroforesis
-Cromatografía de afinidad
-Liofilización
TECNOLOGIA
UTILIZANDO
ENZIMAS
La tecnología de enzimas
involucra la producción,
aislamiento, purificación, uso
en forma soluble y,
finalmente, la inmovilización
de las enzimas para su
utilización en gran variedad
de biorreactores.
La utilización de sistemas
enzimáticos libres de
células, presenta ventajas
respecto de los procesos
químicos que involucran un
número de reacciones
secuenciales.
En fermentación, el uso de
microorganismos como
catalizadores puede
presentar las siguientes
limitaciones:
1. Una alta proporción del
sustrato será utilizada
para convertirse en
biomasa
2. Pueden ocurrir reacciones
secundarias inútiles
3. Las condiciones para el
crecimiento de los
microorganismos pueden
ser diferentes de las
requeridas para la
formación del producto
4. El aislamiento y
purificación del producto
deseado, a partir de la
mezcla de fermentación,
puede ser dificultoso.
INGENIERIA
GENETICA E
INGENIERIA
PROTEICA DE
ENZIMAS
La utilización de estas
técnicas ha posibilitado
producir enzimas
industriales con muy buena
calidad y pureza.
Crecimiento de microorganismos
conteniendo la enzima de utilidad
Purificación de
la enzima
Determinación de
la secuencia parcial
de aminoácidos
Síntesis de
oligonucleótidos
Purificación de mARN
total
mARN
ADN
Clonación del ADN
en E. coli
Identificación de clones
Transformación de microorganismos
Producción industrial de enzima
Objetivos en la preparación de
enzimas modificadas:
1. Aumentar la actividad de las
enzimas
2. Mejorar la estabilidad
3. Permitir que funcionen en un
ambiente diferente
4. Cambiar el pH o temperatura
óptimos
5. Cambiar la especificidad para
que utilice un sustrato
diferente
6. Cambiar la reacción
catalizada
7. Aumentar la eficiencia de un
proceso
ENZIMAS
INMOVILIZADAS
El uso de enzimas en forma
soluble o libre, debe
considerarse como un posible
derroche dado que, en
general, la enzima no puede
recuperarse al final de la
reacción.
Una nueva área de tecnología
enzimática es la relacionada
con la inmovilización de las
enzimas en polímeros
insolubles, tales como
membranas o partículas,
actuando como portadores de
la actividad enzimática.
Las ventajas de los catalizadores
inmovilizados:
1. Permite el reuso de las enzimas
2. Ideal para operaciones continuas
3. Los productos están libres de
enzima
4. Permite un mejor control de los
procesos catalíticos
5. Mejora la estabilidad de las
enzimas
6. Permite el desarrollo de sistemas
de reacción multienzimáticos
7. Ofrece un potencial considerable
en uso médico e industrial
8. Reduce los problemas de
tratamiento de efluentes
ESTERILIZACION Y
ESTERILIDAD
La esterilización es el proceso
de conseguir la esterilidad, para
la que no existen grados: un
objeto, superfcie o sustancia
es, o no es, estéril.
Si es estéril no contiene
organismos viables o células
presentes y, si se le protege
contra la contaminación, la
condición estéril permanecerá
indefinidamente.
La desinfección implica que el
material ha sido tratado a fin
de eliminar o reducir el riesgo
de organismos patógenos, pero
no implica que todos los
organismos viables hayan sido
inactivados.
La esterilización se utiliza
para:
1. Asegurar que un proceso se
lleva a cabo solamente con
el organismo deseado
2. Permitir la utilización
segura de los productos
3. Evitar la contaminación
ambiental
4. Impedir el deterioro de un
producto
La esterilización se lleva a
cabo:
• Eliminando los organismos
viables como en la filtración
• Matándolos de una de las
siguientes formas:
1. Calentando en presencia o
ausencia de agua
2. Irradiando con radiaciones
ultravioleta, gamma o X
3. Tratando con productos
químicos en solución o en
forma gaseosa
Las esporas bacterianas
resisten el calor
(termófilas: 200 kPa a
134oC, 1-10 min, vapor de
agua o calor seco a 180oC,
15 min) y, algunas, las altas
dosis de radiación
(Deinococcus radiodurans:
6000 krad).
La esterilización debe ser
capaz de eliminar las
esporas más resistentes de
las especies más
resistentes.
Muerte por calentamiento:
En la esterilización húmeda,
el vapor a presión tiene
dos funciones
importantes:
1. Condensándose sobre el
material permite que el
calor se transfiera
rápidamente causando un
aumento rápido de la
temperatura
2. Las propias moléculas de
agua aumentan, o al menos
mantienen el nivel de
hidratación dentro de la
espora.
En la esterilización por calor
seco, el calor es transferido muy
lentamente y la tendencia es
reducir más el nivel de
hidratación y, de esta forma, se
protegen las proteínas de las
esporas.
Las esporas son
considerablemente más
resistentes al calor seco que al
calor húmedo.
Radiación
La radiación ultravioleta no
es muy penetrante y no se
puede confiar en ella como
agente esterilizante, a menos
que se pueda garantizar la
exposición directa del
organismo contaminante.
Los rayos gamma y X son más
útiles debido a su alto poder
de penetración.
Determinación de la destrucción
de microorganismos:
•Tiempo térmico letal: tiempo
más corto que lleva destruir los
microorganismos a una
temperatura determinada
•Punto térmico letal:
temperatura más baja que se
necesita para matar a los
organismos en 10 minutos.
Para ambos se necesita saber el
tamaño inicial de la población y
las condiciones precisas. No son
particularmente útiles.
Un parámetro más útil es:
•Tiempo de reducción
decimal o valor D: tiempo en
minutos, a una temperatura
determinada, que se
requiere para reducir la
población viable al 10% de
su valor previo.
•Valor-Z: es el cambio de
temperatura que se
requiere para modificar el
valor D por un factor de 10.
Métodos prácticos:
Calentamiento:
Para comparar las capacidades
relativas de esterilización de los
diferentes procesos de
calentamiento, se requiere una
unidad de letalidad.
La unidad escogida es el efecto letal
de un minuto de calentamiento, a la
temperatura de 121oC.
F = t * 10(T-121)/z
Donde t= tiempo de aplicación del
tratamiento letal; T= temperatura
en oC y z= aumento de temperatura
requerido para reducir el período de
calentamiento en un 90% (es decir
el valor z).
En la industria alimentaria el
peligro más serio para la salud
es la presencia de Clostridium
botulinum, el formador de
esporas patogénico más
resistente al calor, así como el
agente más tóxico.
En esterilización clínica:
Calor húmedo:
Vapor a 134oC (30 psi), 3 min
Vapor a 126oC (20 psi), 10 min
Vapor a 121oC (15 psi), 15 min
Vapor a 115oC (10 psi), 20 min
Como los valores de D para
las esporas son, a 121oC, del
orden de 0,2 min, un tiempo
de mantenimiento de 15 min
de vapor a 121oC equivale a
75xD, lo que hace la
probabilidad de fallo en
relación a la supervivencia de
C. botulinum casi
imposiblemente remota.
Procesos discontinuos:
Autoclaves:
Todo el aire debe ser
eliminado antes del ciclo de
calentamiento, ya que mezclas
de aire y vapor a una presión
determinada alcanzarán una
temperatura más baja que la
del vapor puro a la misma
presión.
Inyección directa del vapor:
Si se utilizan inyecciones
directas de vapor se debe
tener en cuenta que entre el
10 y el 20% del volumen final
se deberán a condensación.
Mientras la eficiencia térmica
de este proceso es alta, la
fuerte formación de espuma
durante el burbujeo puede
limitar la transferencia del
calor.
Calentamiento indirecto:
Pasando vapor de agua a través
de una espiral de intercambio
de calor o de una camisa. El
calor en este procedimiento es
menos eficiente que por
inyección directa y, en ambos
casos, permanecen los
problemas de enfriamiento,
generalmente conseguido
mediante espirales.
Esterilización por flujo continuo:
En el diseño del equipo deben
considerarse las tres etapas
del ciclo, para conseguir:
1. Un rápido calentamiento
2. Un tiempo de mantenimiento a
la temperatura de
esterilización
3. Un rápido enfriamiento
Esterilización por
radiaciones:
Normalmente se lleva a cabo
con una fuente de cobalto-60
o de cesio-137.
El efecto letal es siempre
mayor en presencia de
oxígeno y alto contenido en
agua.
La unidad de medida de la
dosis de radiación es el rad,
equivalente a una energía de
absorción de 100 ergs/g de
aire. El Roentgen (R) es 83
ergs/g de aire.
Esterilización química:
•Formaldehído: solamente
efectivo si se puede
garantizar que entre en
contacto con los organismos
contaminantes. Pobre
difusibilidad y poder de
penetración. Olor picante y
duradero. Solamente en
casos especiales.
•Peróxido de hidrógeno:
poderoso agente oxidante
que mata células vegetativas
y esporas con actividad
creciente con la
concentración, temperatura
y normalmente pH. Sus
productos de degradación
son inocuos.
•Oxido de etileno y de
propileno: pueden utilizarse en
forma gaseosa. El de etileno
es más efectivo pero
altamente tóxico, irritante y
violentamente explosivo en
mezclas con aire. Su efecto
letal sobre las bacterias
depende de la humedad; las
condiciones óptimas incluyen
40-80% de humedad relativa
y temperatura de 60oC
durante 3-4h, para una
concentración de gas de 8001000 mg/l. El proceso se
utiliza cuando el equipo puede
ser dañado por altas
temperaturas.
Esterilización por filtración:
•Filtros profundos: capa
relativament gruesa de fibra
de vidrio, algodón, lana
mineral, celulosa moldeados
como planchas, tapones o
cilindros.
•Filtros de pantalla:
membranas hechas de
ésteres de celulosa u otros
polímeros
Evaluación de la eficiencia de
esterilización:
1. Termosensores
2. Tubos de Browne: tubos de vidrio
cerrados con 0,15 ml de un fluido
rojo que cambia a verde al aumentar
el calor
3. Tiras de papel impregnadas con
esporas: bioindicadores. Se incuban
luego del tratamiento para evaluar la
supervivencia
4. Tiras indicadoras: responden al calor
húmedo entre 115-123oC. Indican la
dosis de calor por distancia recorrida
de un colorante azul
5. Cinta adhesiva de autoclave: indica
que el vapor, a un mínimo de 120oC,
alcanzó la cinta cuyas rayas se tornan
de blancas a negras. No asegura
esterilidad sino que un objeto ha sido
procesado mediante vapor.
Pruebas de eficiencia de filtración:
1. Prueba del azul de metileno:
para distribución de partícula de
0,02-0,2 micrones
2. Prueba del cloruro sódico: para
que haya esterilización, el filtro
debe retener el 99,997%
3. Esporas de Bacillus: rango de
tamaño 0,7-1 micrón
4. Prueba del bacteriófago T3:
0,03 micrones. Un filtro con
penetración de llama de sodio de
0,001% tiene un equivalente de
0,000005% B. Subtilis y de
0,00005% de T3.
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