Expositores: Castillo, Amalia; Ramallo, Martín;
Laiseca, Julieta; Fassiano, Anabella
The Immortal Strand
Hypothesis: Segregation and
Reconstruction
Thomas A. Rando
Evidencia a favor de la hipótesis
Implicaciones Biológicas
Algunas preguntas claves que han de
ser ensayadas experimentalmente
Células Madre
Epidermis
Capa basal de
células madre
Intestino – Criptas de
Lieberkühn
Células sanguíneas
Constante demanda
sobre las células
madre para dividirse.
• Sitios de control en el
ciclo celular
•Detección y reparación de
mutaciones
Gran posibilidad de acumular mutaciones
críticas que culminen en la formación de
células tumorales.
La Hipótesis de la
Hebra Inmortal
Hugh John Cairns
1975
Hebra
“Abuela”
Hebra
“Madre”
Stem Cell
Célula Madre
Vía de diferenciación
Vía de
proliferación
Hebra
“Abuela”
Hebra
“Madre”
¡ Inmortal !
Mutaciones
…ciertas implicaciones:
• Exenta del acortamiento
telomérico asociado con la
replicación del ADN.
• Se debe asumir que el
intercambio y la recombinación
entre cromátidas hermanas es
particularmente bajo.
• Excepción al mecanismo de
identificación de células madres
por “long term label-retaining”.
Consideraciones del mecanismo
Consideraciones del mecanismo
¿Cómo sabe la célula la edad de cada
una de sus hebras de ADN?
Simplemente….
…no se sabe.
Consideraciones del mecanismo
¿Cómo sabe la célula la edad de cada
una de sus hebras de ADN?
• Modificación covalente de las mismas hebras; Ej:
Metilación.
• Diferencias en la organización de la cromatina según
su edad, a través de la asociación con histonas
(presentan distribución no azarosa) o sus
modificaciones, tales como la acetilación y la
metilación.
• Podrían estar implicados los mecanismos
bioquímicos de establecimiento de los territorios
cromosómicos.
Reconocimiento del
cinetocoro por el huso
mitótico y otras
implicancias moleculares.
Utilización de fármacos
o modelos con genomas
muy estudiados
(Drosophila
melanogaster)
¿Qué evidencias apoyan
esta hipótesis?
• Marcación de fibroblastos embrionarios con
Timidina tritiada (H3-Td) (Lark et al., 1966)
Marcación en las primeras etapas del
desarrollo celular y posterior seguimiento de
las sucesivas generaciones.
Se observó segregación asimétrica de las cadenas más
antiguas, las cuales habían incorporado el marcador.
• Marcación y seguimiento de las células
del epitelio intestinal de ratón (Potten et
al., 1978, 2002)
Estudios a corto y largo plazo en la
progenie de las Stem Cell, por marcación
de las cadenas en el momento de
formación de las Stem Cell.
Los resultados mostraron la retención
del marcador por largo tiempo, siendo
esto consistente con la hipótesis de
la hebra inmortal.
• Estudios de marcación de las cadenas
parentales con H3-Td y Bromodeoxiuridina
(BrdU) (Potten et al., 2002).
Las células marcadas con H3-Td son luego
marcadas con un pulso de BrdU).
En un primer momento, todas las cadenas
marcadas con H3-Td, lo estaban también con
BrdU demostrando que, de hecho, estaban
proliferando.
Luego, se observó la desaparición de BrdU en las
células que aún estaban marcadas con H3-Td,
siendo esto consistente con la hipótesis de la
hebra inmortal.
= H3-Td
= BrdU
Marcación con
BrdU
Progenie de
Stem Cells
Resumiendo…
• Según la Hipótesis de la Hebra Inmortal,
en la replicación de las Stem Cells, se
produciría una segregación asimétrica de
las hebras parentales.
• Esta segregación asimétrica estaría
relacionada con la renovación de las Stem
Cell.
• Las hebras parentales (mayor antigüedad)
segregan juntas para dar origen a una
nueva SC, mientras que las hebras recién
sintetizadas lo hacen en la célula más
diferenciada.
Además…
Este mecanismo permite la conservación
de la información genética, evitando la
acumulación de mutaciones en las SC y
la formación de tumores.
Para completar…
• Interrupción de la segregación
asimétrica en las líneas de SC y análisis
de la presencia de mutaciones e
incidencia de tumores en el tejido.
• A su vez, un SC que pierde la
segregación no al azar, ¿puede generar
otra SC o ambas hijas se diferencian?
• Se debería extender el análisis a otros
tejidos, los cuales generan otro tipo de
diferenciación celular.
Immortal Strands?
Give Me a Break
Peter M. Lansdorp
Idea general
• La clasificación y división de
cromosomas no se llevaría a cabo de
acuerdo a la “edad” del material
genético.
• Explicación alternativa: la división
celular asimétrica y el destino de las
células estaría codirigido por
diferencias epigenéticas entre
cromátidas hermanas.
Introducción
• Hipótesis de la hebra inmortal (1975)
Mecanismo por el cual las células madre
adultas minimizarían la acumulación de
mutaciones que aparecen durante la replicación
del DNA, las que podrían conducir al desarrollo
de cáncer.
• Observado en un número muy
limitado de tipos celulares; difícil de
confirmar experimentalmente.
• Parece probable que la segregación
sea asimétrica en algunas células,
pero quizás el “objetivo” no sea evitar
la adquisición de mutaciones.
• Otra posibilidad División asimétrica
y destino celular codirigido por
diferencias epigenéticas entre
cromátidas hermanas.
Hebras inmortales: ¿existen?
• Hipótesis sólo probada en sistemas mamíferos
donde la identidad de las células madre es incierta.
• Sistemas donde la división asimétrica ocurre
¿qué fracción de divisiones celulares
comprende?
• Evidencias que apoyan la hipótesis
artefactos técnicos.
potenciales
• No hay mecanismos propuestos para la retención
selectiva de la “hebra inmortal”.
• Hipótesis difícil de reconciliar con:
- Errores de replicación no son la única fuente
de mutaciones
modificaciones químicas.
- Ambas hebras del DNA codifican genes
¿algunos genes mejor protegidos que
otros?
- Mecanismos de reparación del DNA
involucran intercambios entre cromátidas
hermanas
interfiere con el mantenimiento
de hebras inmortales.
¿“Suicidio altruísta”?
– Células madre con segregación de hebra
inmortal podrían dividirse más veces porque
se evita el acortamiento de los telómeros
sólo extremo 3´protegido (extremo 5´es
procesado luego de la replicación).
– Segregación selectiva previene acumulación
de mutaciones, cáncer
importancia de
eventos epigenéticos en la formación de
tumores.
¿Son válidas los observaciones
que avalan la hipótesis?
• Número de estudios limitado.
• Aproximaciones indirectas, limitaciones
metodológicas
obtención de células
“individuales” evitaría artefactos como
resultado de la fijación y el procesamiento.
• Células que retienen la marca: ¿células madre
ó postmitóticas diferenciadas?
• Ilustraciones publicadas muestran imágenes
cualitativas, no “cuantitativas”.
Sólo algunas células muestran
segregación asimétrica
• No hay evidencias de que las células de la
línea germinal y células del embrión temprano
muestren segregación asimétrica
¿por qué
stem cells especializadas o progenitoras de
células somáticas necesitarían más protección
contra la acumulación de mutaciones?
• Algunas células de rápida división y con
segregación asimétrica no serían células
madre
células progenitoras que derivan de
un pool de células madre con una tasa de
renovación mucho más lenta.
¿Existe otra explicación?
• La hipótesis de la hebra inmortal
presenta muchas objeciones.
• Resultados experimentales apoyan
fuertemente la hipótesis de la división
asimétrica en ciertas células.
Hipótesis alternativa
Hipótesis alternativa
Lansdorp propone la hipótesis de la
cromátida hermana silenciosa.
Acción de marcas epigenéticas
• Segregación de cromátidas no
azarosa durante la mitosis.
• Expresión diferenciada de genes entre
las células hijas.
La naturaleza y construcción de las
marcas epigenéticas es aún
desconocida.
Hipótesis de
la hebra
inmortal
Hipótesis de la
cromátida
hermana silenciosa
• Se presentan tres
etapas de divisiones.
• Se presentan tres
etapas de divisiones.
• Hay divisiones
asimétricas en las
células madre.
• Hay divisiones
asimétricas en las
células madre.
• El propósito es evitar
la acumulación de
errores en el DNA
durante las sucesivas
replicaciones.
• El propósito es
promover/silenciar la
expresión de genes que
regulan el destino
celular.
High Incidence of NonRandom Template Strand
Segregation and Asymmetric
Fate Determination In
Dividing Stem Cells and their
Progeny
Conboy M, Karasov A, Rando T
INTRODUCCIÓN
Segregación asimétrica de
cromátidas hermanas
Antecedentes
• Originalmente observado en fibroblastos embrionarios
y células del epitelio intestinal.
• Las poblaciones celulares in vivo en las que se observó
este fenómeno son muy pequeñas.
• Estudios en células madre
musculares (células satélite) con
análogos halogenados de timidina
dieron indicios de segregación
asimétrica de cromátidas hermanas
en la división celular.
Objetivos del proyecto
• Estimar la incidencia de la segregación
asimétrica en células miogénicas
utilizando pulsos de análogos halogenados
de timidina y analizando su progenie.
• Contrastar los resultados obtenidos con las
premisas que conforman la hipótesis de
la hebra inmortal.
RESULTADOS
¿Segregación asimétrica?
Daño
Músculo
CldU
2 días
(hebra madre)
Primera ronda de mitosis
IdU
12 horas
(hebra hija)
Segunda ronda de mitosis
• Pares de células de linaje miogénico: Syn-4 +
Pax 7 +
• En replicación: Ki 67 +
• Casi todos los pares marcados con IdU  en
replicación durante el pulso de IdU.
• Herencia asimétrica de CldU  solo en una
de las dos células hijas.
• Segregación asimétrica en casi la mitad de las
células.
• Sistema ex-vivo  alta frecuencia de
cosegregación de las cromátidas marcadas.
• Mioblastos  solo 5% de segregación asimétrica.
• Aunque menos frecuente que en
células satélite, habría un mecanismo
de segregación asimétrica que se
mantiene en el linaje miogénico.
• Los mecanismos que sustentan la
segregación asimétrica de templado
serían más activos en células que se
mantienen en el nicho de “stem cell”.
Confirmación de segregación asimétrica
basada en la edad del templado
• Protocolo de simple cadena:
Daño
Músculo
BrdU
Mitosis
Citocalasina D/Nocodazol
para arrestar citocinesis
• De nuevo, en aproximadamente la mitad de
las divisiones solo una célula hija hereda
DNA marcado  confirman división
asimétrica.
Los templados mas viejos segregan
con la célula hija menos diferenciada
Célula
madre
Célula madre
renovada
Célula de
fenotipo más
diferenciado
Según la hipótesis de la hebra inmortal, la célula
que hereda el templado más antiguo es aquella que
renovará la célula madre, mientras la otra célula hija
presentará un fenotipo más diferenciado
Linaje de células miogénicas
Se marcan las hebras de DNA sintetizadas en la primer
ronda de divisiones con Brd-U y se determina el nivel de
diferenciación de la célula a través de la proteína Desmina,
marcador de células musculares diferenciadas.
Daño
Músculo
BrdU
Se completa la mitosis
Segunda mitosis
Arresto en citocinesis
Revelado con anticuerpos marcados
En el 50% de los pares analizados hay
segregación asimétrica de los templados de
DNA. Hay muchos pares con expresión
diferencial de Desmina en la célula que lleva
el templado marcado.
Se cuantifica la segregación asimétrica de templados
marcados con Brd-U y la expresión de Desmina
79
18
3
Gran relación
entre la herencia
del templado
marcado con un
destino de
mayor grado de
diferenciación
La segregación de los templados más antiguos no
esta limitada a la renovación de las células madre,
pero es lo que ocurre con mayor frecuencia
El 50% de los pares de células recontadas
presentaron división simétrica de Brd-U
59
31
9
Se observa una gran correlación entre la simetría en la
segregación de templados de DNA y la simetría en la expresión
de la proteína Desmina
Sca-1
Stem cell antigen-1
Cuantificación de la expresión de Sca-1 entre los pares de
células hijas con expresión simétrica de Desmina.
Sca-1
BrdU
Desmina
• Evidencia claramente a favor de la
hipótesis de la hebra inmortal.
Sca-1
• Las células más inmaduras, Sca-1+,
experimentan divisiones asimétricas
en la cual la hebra abuela (sin
marca, en este caso) segrega hacia
la célula hija que retiene el fenotipo
menos diferenciado, reflejado por la
expresión de Sca-1.
Sca-1
• La otra célula hija, en contraste,
adquiere las hebras más nuevas
(marcadas en este caso) y adopta
un fenotipo más diferenciado,
reflejado por la expresión de
Desmina.
•Si esto es así, el porcentaje de
células Sca-1+ y también CldU+,
debería disminuir luego de la división
celular…
Daño
Músculo
2 días de incubación
CldU
50%
Aislamiento
(pre-división)
50%
Continúan en
cultivo 12 hs
(post-división)
Cuantificación por FACS para
Sca-1 y CldU
Técnica
de FACS
Se cuantifica el aumento o disminución del
porcentaje de células Sca-1 y CldU
• Disminución del porcentaje de células que expresan Sca-1+
y marcadas con CldU conjuntamente.
• Aumento del porcentaje de células Sca-1- y marcadas con
CldU+.
• La proporción de células que expresan Sca-1 y
marcadas con CldU decrece proporcionalmente
al aumento de células Sca-1-, CldU+.
• Estos resultados son consistentes con la
segregación de las cadenas no marcadas (más
antiguas) junto con las células Sca-1+.
• También, confirman que la proporción de
células que segregan sus cadenas
asimétricamente, expresan Sca-1.
DISCUSIÓN
Se propone un modelo de proliferación de
Stem Cells en respuesta al daño muscular.
• División asimétrica de las SC para generar
mioblastos y células inmaduras
indiferenciadas.
• División simétrica para expandir el pool de
progenitores de mioblastos necesarios para la
reparación del músculo.
• La herencia asimétrica de las hebras en las
divisiones y la asociación del templado más
viejo al fenotipo menos diferenciado es
evidencia a favor de la Hipótesis de la
Hebra Inmortal.
Sin embargo...
• Alta frecuencia en músculo de células
progenitoras que exhiben la segregación de
las cadenas durante el proceso de reparación,
en oposición con la baja frecuencia observada
en otros sistemas in-vivo.
• Una SC retiene la marca
independientemente de la velocidad de
división. La relación entre la retención del
marcador y el estadio de diferenciación podría
variar de tejido en tejido.
• Células con cualquier grado de
diferenciación podrían mantener una
marca suministrada.
Muchas Gracias!!!
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Hipótesis de la hebra inmortal - Departamento de Quimica Biologica