Separación por Precipitación
• Globulinas: proteínas insolubles a bajas concentraciones
de sales; albúminas, solubles
• Solubilidad depende del pH
• Distribución de residuos hidrofóbicos e hidrofílicos en la
superficie de la proteína determina solubilidad
• Solvente siempre acuoso (no en membranas); puede
manipularse para alterar solubilidad de las proteínas de
interés: fuerza iónica, pH, solventes orgánicos miscibles,
otros solutos
+
- +
-
+
+
-
+
-
+
+
-
Región hidrofóbica
Procesos de Fraccionamiento
• Para concentrar una proteína en particular a partir de
una mezcla compleja
• No hay receta universal (ensayo y error)
• En cada paso, la proteína total se divide en una serie de
fracciones; en cada una se busca la proteína de interés
mediante ensayo específico
• Fraccionamiento exitoso: una fracción con alta actividad
específica en donde se haya aumentado la pureza de la
muestra
• Rendimiento: Unidades de enzima en la fracción
Unidades de enzima en prep. Original
• Purificación: actividad específica de fracción
actividad específica original
Fraccionamiento por Desnaturalización
• Diferente sensibilidad de las proteínas al calor
• Determinar a qué temperatura se desnaturaliza la
proteína de interés (pérdida de actividad): Temp. crítica
• Remover a otras proteínas más termolábiles que la de
interés
• Calentar muestra 5-10 ºC por debajo de Temp. Críticax
15-30 min.
• Centrifugar para remover la desnaturalizada
(efecto del sustrato)
• Procedimiento semejante para efecto de pH
Fraccionamiento por Sales
• Sal más comúnmente usada: sulfato de amonio
• Altamente soluble en agua, muy pura, barata,no tiene
efecto sobre la estructura de las proteínas
• Después de la adición de sal, proteínas precipitadas se
centrifugan y se redisuelven en buffer
• Proteínas solubles pueden precipitarse con una
concentración mayor de la misma sal
• Proteína precipitada es “salted out”
• Sal retira la capa de moléculas de agua que rodea a la
superficie de la proteína. Grupos hidrofóbicos permiten
que la proteína se agregue y precipite
Fraccionamiento con Solventes Orgánicos
• Diferente solubilidad de las proteínas en solución
acuosa a solventes orgánicos: etanol, acetona, butanol
• Solvente: disminuye constante dieléctrica del medio 
aumenta atracción entre moléculas cargadas y
disminuye su interacción con el agua
• Solubilidad de la proteína disminuye: grupos
hidrofóbicos son “protegidos” por solvente y grupos
iónicos son dominantes
• Inverso a fraccionamiento con sales: grupos hidrofóbicos
son expuestos
• Puede haber denaturalización y se pierde actividad
Fraccionamiento con Sales
• Proteínas están concentradas en la célula (40%)
• Concentraciones iónicas 0.15 – 0.2 M, pH neutro
• Cuando se extraen condiciones cambian.
+
+
+
+
+
repulsión
-
atracción
+
-
+
+
+
-
% proteína original o
proteína total
100
p ro te in a to ta l
80
E n zim a
60
40
20
0
C o n cen tr ació n d e su lfato d e am o n io
parche hidrofóbico
en proteína
log (solubilidad) = A – m(concentración de sal)
A = constante dependiente de temperatura y pH
m = constante independiente de temperatura y pH
Para calcular cantidad de sulfato de amonio para 1 ml de solución
a 20 ºC necesario para alcanzar la concentración deseada:
g = 533 (S2 – S1)
100 – 0.3S1
% pr oteína pr ecip itada
S1 = concentración inicial de sulfato de amonio
S2 = concentración final
60
40
20
0
20
40
60
80
% d e satu r ació n d e su lfato d e
am o n io
Solubilidad de algunas proteínas puras a pH 7.0 (en mg/ml)
Proteína
A
m
Aldolasa de músculo de conejo
Piruvato quinasa músculo conejo
GlyPi deshidrogenasa m.c.
Lactato deshidrogenasa m.c.
Fosfoglicerato mutasa m.c.
Albúmina sérica bovina
6.30
10.2
8.6
8.0
9.85
9.2
2.84
4.34
2.84
3.97
4.26
3.26
[sulfato amonio]
para solubilidad
de 1 mg/ml (M)
2.20
2.34
3.34
2.02
2.32
2.84
log peso m olecular
6
Fosforilasa
Piruvato kinasa
Aldolasa
Lactato deshidrogenasa
Enolasa
Creatin quinasa
Fosfoglicerato kinasa
5
Mioquinasa
Mioglobina
parvalbúminas
4
0
20
40
60
co n cen tr ació n d e aceto n a (% vo l/vo l)
80
Procesos de Fraccionamiento
• Actividad específica: Unidades totales de enzima en la fracción
Cantidad total de proteína en fracción
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