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Técnicas en biología celular y molecular
CAPÍTULO
18
Técnicas en biología
celular y molecular
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18
Técnicas en biología celular y molecular
Imagen de inicio de capítulo.
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Uso de la fluorescencia de doble marca para seguir los
acontecimientos dinámicos dentro de organelos
celulares. Las cisternas de Golgi de una célula de
levadura en gemación no se organizan en pilas bien
definidas como en la mayor parte de eucariotas, sino
que están dispersas en el citoplasma. Cada una de las
estructuras ovaladas intensamente coloreadas es una
cisterna individual, en la que el color se debe a la
localización de moléculas de proteína con tinción
fluorescente. Las cisternas de color verde contienen
una proteína marcada con GFP (Vrg4) que interviene
en las actividades iniciales del aparato de Golgi,
mientras que las cisternas de color rojo contienen una
proteína marcada con DsRed (Sec7) que participa en
actividades tardías de dicho complejo. Esta serie de
micrografías revela la composición proteínica de
cisternas individuales durante un lapso aproximado de
13 min (el tiempo transcurrido se indica en el ángulo
inferior izquierdo). La punta de flecha y la flecha
señalan dos de estas cisternas todo el tiempo. Estas dos
cisternas se automicrografiaron en las filas inferiores
de las micrografías. En esta serie se aprecia que la
composición proteínica de una cisterna individual
cambia con el tiempo de una con proteínas de Golgi
“tempranas” (verde) a otra con proteínas de Golgi
“tardías” (rojo). Tales descubrimientos dan apoyo visual
directo al modelo de maduración de las cisternas que
se analiza en la página 287. (REIMPRESA CON
AUTORIZACION DE EUGENE LOSEV ET AL., CORTESIA DE BENJAMIN
S. GLICK; NATURE 441:1004, 2006; C COPYRIGHT 2006,
MACMILLAN MAGAZINES LTD.)
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FIGURA 18-1 Diagrama de un corte a través de un
microscopio óptico compuesto,
FIGURA 18-1 Diagrama de un corte a través de un microscopio óptico compuesto, es decir, un
microscopio que tiene lentes tanto de objetivo como oculares.
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FIGURA 18-2 Trayectos que siguen los rayos
de luz que forman la imagen de la muestra y
los que forman la luz de fondo del campo.
Los rayos de luz de la muestra se enfocan en la
retina, mientras que los rayos del fondo están
fuera de foco, con lo que se produce un campo
brillante difuso. Como se explica en el texto, el
poder de resolución de una lente de objetivo
es proporcional al seno del Angulo α. Las
lentes con mayor poder de resolución tienen
longitudes focales mas cortas, lo que significa
que la muestra se sitúa mas cerca de la lente
de objetivo cuando se enfoca.
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FIGURA 18-3 Magnificación contra resolución.
La transición de (a) a (b) proporciona al observador una mayor magnificación y resolución, mientras que
la transición de (b) a (c) solo produce una mayor magnificación (magnificación vacía). De hecho la
calidad de la imagen se deteriora conforme la magnificación vacía aumenta.
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FIGURA 18-4 El poder de resolución del ojo.
Ilustración de la relación entre la estimulación de los fotorreceptores individuales (izquierda) y la
imagen que se percibiría (derecha). El diagrama ilustra el valor de que la imagen caiga en un área lo
bastante grande de la retina.
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FIGURA 18-5 La tinción de Feulgen.
Este procedimiento de tinción es especifico para el DNA, como lo indica la localización del pigmento en
los cromosomas en esta célula de la punta de la raíz de cebolla que estaba en la metafase de la mitosis
al momento que se fijo. (POR ED RESCHKE/ PETER ARNOLD, INC.)
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(a)
(b)
(c)
FIGURA 18-6 Comparación de células vistas con diferentes tipos de microscopios ópticos.
Micrografías ópticas de un protista ciliado tal como se observa en un campo brillante (a), con contraste
de fase (b) y con óptica de contraste por interferencia diferencial (DIC) (o de Nomarski) (c). El organismo
apenas es visible con la iluminación de campo brillante, pero se ve con claridad en la microscopia con
contraste de fase y con DIC. (MICROGRAFIAS POR M. I. WALKER/PHOTO RESEARCHERS, INC.)
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FIGURA 18-7 Uso de variantes de GFP para
seguir las interacciones dinámicas entre
neuronas y sus células blanco in vivo.
(a) Porción de cerebro de un ratón con dos
neuronas fluorescentes de colores
diferentes. Los ratones se obtienen
mediante el apareamiento de animales
transgénicos cuyas neuronas se marcan
con una u otra proteína fluorescente. (b)
Micrografía con fluorescencia de porciones
de dos neuronas, una marcada con YFP y
otra marcada con CFP. Las flechas indican
dos uniones neuromusculares distintas en
dos fibras musculares diferentes en las que
la rama axonal marcada con YFP venció a la
rama marcada con CFP. La tercera unión
esta inervada con el axón marcado con CFP
en ausencia de competencia. (A: CORTESIA DE
N. KASTHURI Y J. W. LICHTMAN, WASH - INGTON
UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE; B: REIMPRESA
CON AUTORIZACIÓN DE NARAYANAN KASTHRUI Y
JEFF W. LICHTMAN, NATURE 424:429, 2003; C
COPYRIGHT 2003, MACMILLAN MAGAZINES LTD.)
(a)
(b)
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FIGURA 18-8 Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET).
Este esquema muestra un ejemplo del uso de la tecnología FRET para seguir el cambio en la conformación de una
proteína (PKG) después de la unión con cGMP. Las dos proteínas pequeñas fluorescentes con forma de barril (CFP
intensificada [ECFP] y YFP intensificada [EYFP]), se muestran en su color fluorescente. En ausencia de cGMP, la
excitación de ECFP con luz de 440 nm produjo la emisión de luz de 480 nm de la proteína fluorescente. Después de la
unión con cGMP, un cambio en la conformación en PKG aproxima lo suficiente las dos proteínas fluorescentes para que
la FRET ocurra. Como resultado la excitación del donador de ECFP con luz de 440 nm produce la transferencia de
energía al receptor de EYFP y la emisión de luz de 535 nm del receptor. Las versiones intensificadas de estas proteínas
tienen mayor intensidad de fluorescencia y tienden a ser más estables que la molécula proteínica original. (TOMADA DE
MORITOSHI SATO ET AL., POR CORTESIA DE YOSHIO UMEZAWA, ANAL. CHEM. 72:5924, 2000.)
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FIGURA 18-9 Microscopia de fluorescencia
confocal con exploración láser.
(a) Los trayectos de la luz en un microscopio de fluorescencia confocal. La luz de
longitud de onda corta (azul) proviene de una fuente laser, pasa por una abertura
diminuta y se refleja en un espejo dicroico (un tipo de espejo que refleja ciertas
longitudes de onda y transmite otras) una lente objetivo y se enfoca en una mancha
en el plano de la muestra. Los fluorocromos de la muestra absorben la luz incidente
y emiten luz de mayor longitud de onda, la cual puede pasar por el espejo dicroico y
enfocarse en un plano que contiene una abertura puntual. Luego, la luz pasa a un
tubo fotomultiplicador que amplifica la señal y la transmite a una computadora, la
cual forma una imagen procesada digitalizada. Cualquier rayo de luz emitido por
arriba o debajo del plano óptico de la muestra no pasa por la abertura diminuta, por
lo que no contribuye a la formación de la imagen. Este diagrama muestra la
iluminación de un solo punto en la muestra. Distintos sitios de la muestra se
iluminan mediante un proceso de barrido con laser. El diámetro de la abertura
puntual es ajustable. Mientras menor sea la abertura, es mas delgado el corte
óptico y mayor la resolución, pero la señal es menos intensa. (b) Micrografías con
fluorescencia confocal de tres cortes ópticos separados, cada uno de 0.3 μm de
grosor, de un núcleo de levadura tenido con dos anticuerpos con marca
fluorescente distinta. El anticuerpo fluorescente rojo tino el DNA dentro del núcleo
y el anticuerpo fluorescente verde tino una proteína de unión con el telomero que
se localiza en la periferia del núcleo. (Tomada de Thierry Laroche y Susan M. Gasser,
Cell 75:543, 1993, con autorizacion de Cell Press.)
(a)
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(b)
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FIGURA 18-10 Superación del límite de resolución del microscopio óptico.
(a) Micrografía de fluorescencia convencional de una porción de una célula cultivada de mamífero con microtúbulos
marcados en verde y los fosos cubiertos con clatrina en rojo. Con este nivel de magnificación, la imagen se ve difusa.
Además, la superposición entre las dos marcas fluorescentes produce un color naranja, que sugiere que ambas
estructuras están interconectadas. (b) Micrografía STORM de “super resolución” de un campo similar que muestra los
microtúbulos y los fosos cubiertos con clatrina con buena resolución y separados entre si. (c) Vista magnificada de una
porción de la imagen b. (La explicación de esta y otras técnicas de super resolución puede encontrarse en Na- ture
Revs. Mol. Cell Biol. 9:929, 2008.) (TOMADA DE MARK BATES ET AL., POR CORTESIA DE XIAOWEI ZIHUANG, SCIENCE 317:1752, 2007;
C COPYRIGHT 2007, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE.)
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(a)
(b)
FIGURA 18-11 Comparación entre la información obtenida en las imágenes tomadas con un microscopio
óptico y uno electrónico con una magnificación comparable de 4 500 veces el tamaño real.
(a) Fotografía del tejido muscular esquelético que se impregno en plástico, se corto a 1 μm y se fotografió con un
microscopio óptico con una lente de objetivo para aceite de inmersión. (b) Corte adyacente al empleado para la parte a
que se corto a 0.025 μm y se examino al microscopio electrónico con una magnificación comparable a la imagen en a.
La imagen resultante presenta un aumento de cien a doscientos en la resolución. Nótese la diferencia en los detalles de
las miofibrillas musculares, las mitocondrias y el eritrocito contenido en el capilar. Mientras que el microscopio óptico
no puede proporcionar ninguna información adicional a la de a, es posible que el microscopio electrónico brinde
mucha mas información; por ejemplo, puede producir imágenes de la estructura de membranas individuales dentro de
una pequeña porción de una de las mitocondrias (como en la figura 5-21). (CORTESÍA DE DOUGLAS E. KELLY Y M. A. CAHILL.)
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FIGURA 18-12 Comparación del sistema de
lentes de un microscopio óptico y uno
electrónico.
(TOMADA DE W. AGAR, PRINCIPLES AND PRACTICE
OF ELECTRON MICROSCOPE OPERATION,
ELSEVIER/NORTH- HOLLAND, 1974.)
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FIGURA 18-13 Preparación de una muestra para observación en el microscopio electrónico.
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FIGURA 18-14 Ejemplos de muestras con
tinción negativa y sombras metálicas.
Micrografía electrónica de un virus cascabel
de tabaco después de la tinción negativa con
fosfotungstato de potasio (a) o proyección
de sombra con cromo (b). (CORTESIA DE M. K.
CORBETT.)
(a)
(b)
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FIGURA 18-15 Procedimiento utilizado para
la proyección de sombras por medio de
contraste en el microscopio electrónico.
A menudo este procedimiento se emplea para
visualizar partículas pequeñas, como los virus
que se muestran en la figura previa. Con
frecuencia las moléculas de DNA y RNA se
hacen visibles por una modificación de este
procedimiento que se conoce como formación
de sombras rotatorias, en el que el metal se
evapora en un ángulo muy bajo mientras se
gira la muestra.
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FIGURA 18-16 Procedimiento para la
formación de réplicas por congelamiento y
fractura como se describe en el texto.
El procedimiento de congelación y grabado es
un paso opcional en el que una capa delgada
de hielo que cubre la muestra se evapora para
revelar información adicional de la estructura
de la superficie de la muestra fracturada
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FIGURA 18-17 Réplica de una célula de raíz
de cebolla congelada y fracturada que
muestra la envoltura nuclear (N.E.) con sus
poros nucleares (N.P.), el aparato de Golgi (G),
una vacuola citoplásmica (V) y la pared celular
(C.W.). (Cortesía de Daniel Branton.)
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FIGURA 18-17 Réplica de una célula de raíz de
cebolla congelada y fracturada
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FIGURA 18-18 Grabado profundo.
Micrografía electrónica de axonemas ciliares
del protozoario Tetrahymena. Los axonemas se
fijaron, congelaron y fracturaron, el agua
congelada de la superficie del bloque
fracturado se evaporo, lo que dejo una porción
de los axonemas en relieve, tal como se
visualiza en esta replica metálica. La flecha
indica una hilera distintiva de brazos de
dineina. (TOMADA DE URSULA E. GOODENOUGH Y
JOHN E. HEUSER, J. CELL BIOL. 95:800, 1982.
MEDIANTE AUTORIZACIÓN DE DERECHOS RESERVADOS
DE LA ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS.)
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(b)
(a)
FIGURA 18-19 Microscopia electrónica de barrido.
Micrografías electrónicas de barrido de (a) un bacteriofago T4 (×275 000) y (b) la cabeza de un insecto (×40).
(A: REIMPRESA CON AUTORIZACIÓN DE A. N. BROERS, B. J. PANESSA Y J. F. GENNARO, SCIENCE 189:635, 1975; C DERECHOS
RESERVADOS 1975, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE; (A) B: CORTESÍA DE H. F. HOWDEN Y L. E. C.
LING.)
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FIGURA 18-20 Procedimiento paso a paso
para la preparación de una autorradiografía.
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(a)
(b)
FIGURA 18-21 Ejemplos de autorradiografías microscópica óptica y electrónica.
(a) Autorradiografías microscópica óptica de un cromosoma del politeno del insecto Chironomus, que muestra la incorporación
extensa de [3H]uridina en el RNA en las regiones purificadas del cromosoma. Las autorradiografías de este tipo confirmaron que
los penachos de los cromosomas son sitios de transcripción. Esta micrografía puede compararse con la de la figura 10-8b, que
muestra el mismo cromosoma como se observa en el microscopio electrónico de barrido. (b) Autorradiografías microscópica
electrónica de una célula de medula ósea incubada en [35S]O4 durante 5 min y fijada de inmediato. La incorporación de sulfato
(revelada por los pequeños granos negros de plata), se localiza en el aparato de Golgi (flecha). (A: TOMADA DE C. PELLING,
CHROMOSOMA 15:98, 1964; B: TOMADA DE R. W. YOUNG, J. CELL BIOL. 57:177, 1973; MEDIANTE AUTORIZACIÓN DE DERECHOS DE LA ROCKEFELLER
UNIVERSITY PRESS.)
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(a)
(b)
FIGURA 18-22 Comparación de la morfología de células que crecen en cultivos 2D y en cultivos 3D.
(a) Fibroblasto humano que crece en un sustrato plano cubierto con fibronectina en un cultivo 2D
asume una forma muy aplanada con lamelipodios anchos. Las adhesiones que contienen integrina se
ven blancas. (b) El mismo tipo de célula cultivada en una matriz 3D asume una conformación fusiforme
no aplanada. La matriz de fibronectina extracelular aparece en azul. La barra equivale a 10 μm. (TOMADA
DE KENETH M. YAMADA Y EDNA CUKIERMAN, CELL 130:603, 2007, CON AUTORIZACION DE CELL PRESS.)
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FIGURA 18-23 Purificación de fracciones subcelulares por centrifugación de equilibrio con gradiente
de densidad.
En este ejemplo particular, el medio se compone de un gradiente de densidad continuo de sacarosa y
los distintos organelos se sedimentan hasta que llegan a un sitio en el tubo igual a su propia densidad,
donde forman bandas. La partícula de 20 000 g se obtiene como se muestra en la figura 8-5.
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FIGURA 18-24 Cromatografía por intercambio iónico.
Separación de dos proteínas mediante DEAE-celulosa. En este caso, una resina de intercambio con carga
positiva se usa para unirse con la proteína con mayor carga negativa.
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FIGURA 18-25 Cromatografía de filtración en gel.
Separación de tres proteínas globulares con diferente masa molecular, como se describe en el texto.
Entre las proteínas con forma básica similar, las moléculas mas grandes se eliminan antes que las
pequeñas.
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FIGURA 18-26 Cromatografía por afinidad.
(a) Representación esquemática de las cuentas
cubiertas con agarosa con las que solo puede
combinarse una proteína especifica. (b) Pasos
del procedimiento cromatográfico.
(a)
(b)
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FIGURA 18-27 Uso del sistema de dos
híbridos de levaduras.
Esta prueba para la interacción entre dos
proteínas depende de que una célula sea capaz
de reunir dos partes de un factor de transcripción.
(a) Las dos partes del factor de transcripción (el
dominio para unión con DNA y el dominio de
activación), se ven aquí conforme el factor de
transcripción se une con el promotor de un gen
(lacZ) que codifica la galactosidasa β. (b) En este
caso, una célula de levadura sintetizo el dominio
para unión con DNA del factor de transcripción
unido con una proteína X “carnada”. Este
complejo no puede activar la transcripción. (c) En
este caso, una célula de levadura sintetizo el
dominio de activación del factor de transcripción
unido con una proteína Y desconocida “pescado”.
Este complejo no puede activar la transcripción.
(d) Una célula de levadura sintetizo las proteínas X
y Y, lo que reconstituye un factor de transcripción
completo y permite la expresión de lacZ, que es
fácil de detectar. (e) Si el segundo DNA codifico
una proteína, por ejemplo, Z, que no pudo unirse
con X, la expresión del gen reportero no se habría
detectado.
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FIGURA 18-28 Electroforesis en gel de
poliacrilamida.
Las muestras de proteína suelen disolverse en
una solución de sacarosa cuya densidad
impide que la muestra se mezcle con el
amortiguador y luego se carga en los pozos
con una pipeta fina como se muestra en el
paso 1. En el paso 2 se aplica una corriente
directa al gel, lo que ocasiona que las
proteínas se muevan en la poliacrilamida en
carriles paralelos. Cuando se realiza en el
detergente SDS, como casi siempre sucede, las
proteínas se mueven como bandas a
velocidades inversamente proporcionales a su
masa molecular. Una vez que la electroforesis
se completa, el gel se retira del marco de
vidrio y se tiñe en una charola (paso 3).
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FIGURA 18-29 Electroforesis bidimensional
en gel.
Gel de poliacrilamida bidimensional de
proteínas cromosómicas no histonas de la
célula HeLa marcadas con [35S]metionina.
Con esta técnica pueden resolverse mas de
mil proteínas diferentes. (TOMADA DE J. L.
PETERSON Y E. H. MCCONKEY, J. BIOL. CHEM.
251:550, 1976.)
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FIGURA 18-30 Principios de operación de un espectrómetro de masa.
(TOMADA DE J. E. BRADY, J. RUSSELL Y J. R. HOLUM, CHEMISTRY, 3RD ED. DERECHOS RESERVADOS © 2000, JOHN WILEY
AND SONS, INC. REIMPRESA CON AUTORIZACIÓN DE JOHN WILEY AND SONS, INC.)
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FIGURA 18-31 Análisis por difracción de rayos X.
Diagrama de la difracción de rayos X por átomos de un plano de un cristal en una placa fotográfica. La
serie ordenada de los rayos dentro del cristal produce una serie repetitiva de ondas circulares
superpuestas que se dispersan e intersecan la película. Como sucede con la difracción de la luz visible,
las ondas forman un patrón de interferencia que refuerzan unas a otras en algunos puntos de la película
y se cancelan entre si en otros puntos.
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(a)
(b)
(c)
(d)
FIGURA 18-32 Distribución de densidad electrónica de una pequeña molécula orgánica
(dicetopiperacina) calculada con varios niveles de resolución.
Con la resolución mas baja (a) solo puede distinguirse la naturaleza anular, mientras que la resolución
mas alta (d) revela la densidad electrónica alrededor de cada átomo (indicada por las líneas de contorno
circular). (TOMADA DE D. HODGKIN. REIMPRESA CON AUTORIZACIÓN DE NATURE 188:445, 1960. © DERECHOS
RESERVADOS 1960, MACMILLAN MAGAZINES LTD.)
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Técnicas en biología celular y molecular
FIGURA 18-33 La combinación de datos de
microscopia electrónica y cristalografía de
rayos X proporciona información sobre
interacciones entre proteínas y sobre la
estructura de complejos multisubunitarios. La
reconstrucción basada en micrografías
electrónicas de un filamento de actina- ADF se
muestra en gris. Las estructuras obtenidas por
cristalografía de rayos X de alta resolución de
monómeros individuales de actina (rojo) y
moleculas de ADF (verde) se ajustaron en la
estructura determinada por EM, con menor
resolución. (TOMADA DE VITOLD E. GALKIN ET AL.,
CORTESÍA DE EDWARD H. EGELMAN, J. CELL BIOL.
163:1059, 2003; CON AUTORIZACIÓN DEL TITULAR
DEL COPYRIGHT, ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS.)
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FIGURA 18-33 La
combinación de
datos de microscopia
electrónica y
cristalografía de
rayos X
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FIGURA 18-34 Separación de fragmentos de
restricción de DNA por electroforesis en gel.
(a) El DNA se incuba con una enzima de restricción,
que lo corta en fragmentos (pag. 746). La mezcla de
fragmentos se introduce en una ranura o foso en
una placa de agarosa y se aplica corriente eléctrica.
Las moléculas de DNA con carga negativa emigran
hacia el electrodo positivo y se separan por tamaño.
(b) Todos los fragmentos de DNA que están
presentes en un gel pueden revelarse mediante la
inmersión del gel en una solución de bromuro de
etidio para luego observar el gel con luz ultravioleta.
(B: FOTOGRAFIA DE PHILLIPE PLAILLY/SCIENCE PHOTO
LIBRARY/PHOTO RESEARCHERS.)
(b)
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(a)
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FIGURA 18-35
Técnicas de
sedimentación
de ácido
nucleico.
(b)
(a)
(a) Separación de moléculas de DNA de diferente tamaño por la
velocidad de sedimentación. El gradiente de densidad de la sacarosa se
establece dentro del tubo (paso 1) al permitir que una solución de
sacarosa de concentración cada vez mayor drene por la pared del tubo.
Una vez que el gradiente se forma, la muestra se divide en capas con
cuidado en la parte alta del gradiente (pasos 2 y 3), y el tubo se somete a
centrifugación (p. ej., 50 000 rpm durante 5 h) como se ilustra en el paso
4. Las moléculas de DNA se separan con base en su tamaño (paso 5). (b)
Separación de las moléculas de DNA por sedimentación de equilibrio con
base en las diferencias en la composición. La muestra de DNA se mezcla
con la solución de CsCl (paso 1) y se somete a centrifugación prolongada
(p. ej., 50 000 rpm durante 72 h). El gradiente de CsCl se forma durante
la centrifugación (paso 2) y las moléculas de DNA forman bandas en
regiones de densidad equivalente (paso 3). (c) El tubo del experimento b
se punciona y se permite que el contenido gotee a tubos sucesivos, lo
que fracciona el contenido del tubo. Se mide la absorbancia de la
solución en cada fracción y se grafica como se muestra.
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(c)
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FIGURA 18-36 Identificación de la localización de fragmentos de DNA específicos en un gel por el
método Southern.
Como se describe en la figura, los fragmentos fraccionados de DNA se desnaturalizan y transfieren a una
membrana de nitrocelulosa, que se incuba con sondas de DNA (o RNA) con marca radiactiva. La localización de los
fragmentos híbridos se realiza mediante autorradiografía. Durante el procedimiento de manchado, la acción
capilar atrae el amortiguador hacia arriba a las toallas de papel. Conforme el amortiguador se mueve por el gel
electroforético, disuelve los fragmentos de DNA y los transfiere a la superficie de la membrana adyacente.
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FIGURA 18-37 Construcción de un mapa de
restricción del pequeño genoma circular del
virus tumoral de DNA del polioma.
(a) Autorradiografías de fragmentos de DNA
marcados con 32P que se sometieron a
electroforesis en gel. El gel del lado izquierdo
muestra el patrón de los fragmentos de DNA
obtenidos después de la digestión completa
del genoma de polioma con la enzima HpaII.
Para determinar cómo se reúnen estos ocho
fragmentos para conformar el genoma
intacto es necesario tratar el DNA de tal
manera que se genere superposición de
fragmentos que puede producirse mediante
el tratamiento del genoma intacto con una
segunda enzima que divide la molécula en
sitios diferentes o por el tratamiento del
genoma con la misma enzima en condiciones
distintas en las que el DNA no se digiera por
completo como sucedió en el gel de la
izquierda. Las dos muestras de la derecha
representan ejemplos de digestiones
parciales del genoma del polioma con HpaII.
El gel central muestra los fragmentos
generados por la digestión parcial del DNA
circular super helicoidal y el gel de la derecha
muestra los fragmentos HpaII formados
después que el genoma circular se convierte
en una molécula lineal por acción de EcoR1
(una enzima que solo hace un corte en el
circulo). (Continúa…)
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Técnicas en biología celular y molecular
FIGURA 18-37 Construcción de un mapa de restricción del pequeño genoma circular del virus tumoral
de DNA del polioma. (Continuación)
… (b) Mapa de restricción del genoma de polioma alineado con base en la división hecha con HpaII. Se
ilustran los ocho fragmentos de la digestión completa junto con el DNA en la parte superior. Los
fragmentos superpuestos de la digestión parcial se muestran en su disposición ordenada por debajo del
mapa. (Los fragmentos L y M migran al fondo del gel en la parte a, lado derecho.) (TOMADA DE BEVERLY E.
GRIFFIN, MIKE FRIED Y ALLISON COWIE, PROC. NAT’L. ACAD. SCI. U.S.A. 71:2078, 1974.)
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Técnicas en biología celular y molecular
FIGURA 18-38 Formación de una molécula de
DNA recombinante.
En este ejemplo una preparación de plasmidos
bacterianos se trata con una enzima de
restricción que hace un solo corte dentro de
cada plasmido bacteriano. Dicha enzima se
utiliza para fragmentar una preparación de
DNA genómico humano en pequeños
fragmentos. Como se trataron con la misma
enzima de restricción, el DNA del plasmido
dividido y los fragmentos de DNA humano
tienen extremos adherentes. Cuando estas dos
poblaciones se incuban juntas, las dos
moléculas de DNA se unen en forma covalente
entre si y luego se sellan también en forma
covalente con la ligasa de DNA, para formar
una molécula de DNA recombinante.
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Técnicas en biología celular y molecular
FFIGURA 18-39 Ejemplo de clonación de DNA
con plásmidos bacterianos.
El DNA se extrae de células humanas, se
fragmenta con EcoR1 y los fragmentos se
insertan en una población de plasmidos
bacterianos. Se cuenta con técnicas para
prevenir la formación de plasmidos que
carecen del inserto de DNA ajeno. Una vez que
la célula bacteriana capto un plasmido
recombinante del medio, la célula da origen a
una colonia de células que contienen la
molécula de DNA recombinante. En este
ejemplo la mayor parte de las bacterias
contiene DNA de eucariotas con función
desconocida (marcados cómo ?), mientras que
uno contiene una porción del DNA que
codifica RNA ribosómico y otro contiene DNA
que codifica insulina.
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Técnicas en biología celular y molecular
(b)
(a)
FIGURA 18-40 Localización de una colonia bacteriana que contiene una secuencia deseada de DNA
por réplica en placa e hibridación in situ.
(a) Una vez que las células bacterianas se colocaron en placas en medios de cultivo y que proliferaron, la caja
se invierte sobre un trozo de papel filtro y se permite que algunas de las células de cada colonia se adsorban al
papel. Se inoculan placas de cultivo vacías al presionarlas contra el papel filtro a fin de reproducir replicas de la
placas. (b) Procedimiento para revisar las células de una placa de cultivo en busca de las colonias que
contengan el DNA recombinante de interés. Una vez que las colonias relevantes se identifican, las células
pueden retirarse de la placa original y cultivarse por separado para obtener grandes cantidades de los
fragmentos buscados de DNA.
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Técnicas en biología celular y molecular
FIGURA 18-41 Separación del DNA del
plásmido del DNA del cromosoma bacteriano
principal mediante centrifugación de
equilibrio con CsCl.
Puede verse que este tubo de centrifugación
contiene dos bandas, una de DNA del
plásmido que tiene un segmento de DNA
ajeno que se clono dentro de las bacterias y la
otra contiene DNA cromosómico de estas
mismas bacterias. Los dos tipos de DNA se
separaron durante la centrifugación (fig. 1835b). El investigador retira el DNA del tubo con
aguja y jeringa. El DNA del tubo se hace visible
con el compuesto de unión al DNA bromuro de
etidio, que produce fluorescencia bajo luz
ultravioleta. (FOTOGRAFÍA DE TED SPEIGEL/CORBIS
IMAGES.)
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Técnicas en biología celular y molecular
FIGURA 18-42 Protocolo para la clonación de
fragmentos de DNA eucariota en un fago
lambda.
Los pasos se describen en el texto.
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Técnicas en biología celular y molecular
FIGURA 18-43 Reacción en cadena
de la polimerasa (PCR).
Como se explica en el texto, el
procedimiento emplea la
polimerasa de DNA resistente al
calor, cuya actividad no se elimina
cuando la temperatura se eleva
para separar dos cadenas de la
doble hélice. Con cada ciclo de
duplicación, las cadenas se
separan, los segmentos de
flanqueo (cebadores) se unen con
los extremos de la región
seleccionada y la polimerasa copia
el segmento intermedio.
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Técnicas en biología celular y molecular
FIGURA 18-44 Secuenciación de DNA.
(a) Pasos básicos en la identificación de la
secuencia de un pequeño fragmento hipotético
mediante la técnica de Sanger-Coulson
(didesoxi), como se describe en el texto. (b)
Carriles de gel en que las moléculas hijas con
marca fluorescente se separaron. El color de la
banda se determina por la identidad del
didesoxinucleotido en el extremo 3' de la
cadena de DNA. (c) La secuencia de
nucleótidos en la cadena plantilla se interpreta
en una computadora que “lee” de abajo hacia
arriba en el gel, usando como entrada la
intensidad y la longitud de onda de la luz
fluorescente. La computadora genera un
“electroferograma” que muestra la intensidad y
el color de la fluorescencia detectada, junto
con la interpretación de la secuencia de DNA.
(B Y C: REIMPRESAS CON AUTORIZACIÓN DE LEROY
HOOD Y DAVID GALAS, NATURE 421:445, 2003; C
DERECHOS RESERVADOS 2003, MAC - MILLAN
MAGAZINES LTD.)
(b)
(a)
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(C)
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Técnicas en biología celular y molecular
FIGURA 18-45 Síntesis de cDNA para clonación en un plásmido.
(a) En este método de
formación de cDNA, un
cebador corto poli(dT) se une
con el poli(A) de cada mRNA
que se transcribe por acción
de la transcriptasa inversa
(que necesita el cebador para
iniciar la DNA síntesis). Una
vez que el hibrido DNA-RNA
se forma, se producen
muescas en el RNA mediante
RNA-asa H y se agrega una
DNA polimerasa para digerir
el RNA y sustituir el DNA,
justo como ocurre durante la
replicación de DNA en una
célula bacteriana (pag. 545).
(b) Para preparar cDNA de
extremos romos para la
clonación se agregan un
pequeño fragmento de
poli(G) a los extremos 3' del
cDNA y un segmento
complementario de poli(C) a
los extremos 3' del DNA
plásmido. Los dos DNA se
mezclan y se permite que
formen recombinantes, que
se sellan y usan para
transformar las células
bacterianas en las que se
clonan.
(b)
(a)
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Técnicas en biología celular y molecular
FIGURA 18-46 Microinyección de DNA en el núcleo de un huevo de ratón recién fertilizado.
El huevo se mantiene en su sitio con una pipeta de succión que se muestra a la derecha, mientras que
la pipeta de inyeccion que penetra el huevo se muestra a la izquierda. (TOMADA DE THOMAS E. WAGNER ET
AL., PROC. NAT’L. ACAD. SCI. U.S.A. 78:6377, 1981.)
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FIGURA 18-47 Ratones transgénicos.
Esta fotografía muestra un par de
hermanos de la misma camada a las 10
semanas de edad. El ratón mas grande
se desarrollo de un huevo inyectado
con DNA que contenía el gen de la
hormona del crecimiento de la rata,
que se coloco en dirección 3' del
promotor de metalotioneína. El ratón
mas grande pesa 44 g; el mas pequeño,
el testigo no inyectado pesa 29 g. El
gen GH de rata se transmitió a los
descendientes que también crecieron
más que los testigos. (CORTESÍA DE RALPH
L. BRINSTER, DE UN TRABAJO PUBLICADO EN
R. D. PALMITER ET AL., NATURE, 300:611,
1982.)
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Técnicas en biología celular y molecular
FIGURA 18-48 Formación de plantas
transgénicas con el plásmido Ti.
El transgen se incluye en el DNA del plásmido
Ti, que se reintroduce en la bacteria huésped.
Las bacterias que contienen el plásmido
recombinante se usan luego para transformar
células vegetales, en este caso las células del
meristemo en el extremo superior de una
punta disecada de la raíz. Los brotes
transformados se transfieren a un medio de
selección, donde desarrollan raíces. Las
plantas enraizadas pueden transferirse a tierra.
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FIGURA 18-49 Formación de ratones con
bloqueo génico.
Los pasos se describen en el texto.
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FIGURA 18-50 Determinación de la función génica
por interferencia del RNA.
La figura muestra una galería de imágenes de células
cultivadas de Drosophila que se incubaron con varios
siRNA de cadena doble. Las células mostradas se
acumularon en metafase por un tratamiento
separado que bloqueo el avance hacia la anafase.
Durante el estudio se examinaron más de 4 millones
de células. Fue posible someter a detección a una
gran cantidad de células mediante la selección
computarizada de las imágenes de células que
estuvieran en metafase para luego elegir y ensamblar
las imágenes en paneles como el que se muestra en
esta fotografía. Así, podía buscarse la presencia de
husos mitóticos anormales, ya fuera por
observadores humanos o por análisis computarizado
con programas diseñados para detectar
características especificas de un huso anormal. (POR
CORTESÍA DE GOHTA GOSHIUMA Y RONALD D. VALE, DE UN
ESTUDIO EN SCIENCE 316:417, 2007.)
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FIGURA 18-51 Determinación de la función génica por interferencia del RNA.
(Izquierda) Una célula de mamífero cultivada no tratada en la metafase de la mitosis. (Derecha) El mismo tipo
de célula se trato con un dsRNA de 21 nucleótidos diseñado para inducir la destrucción de los mRNA que
codifican la cinasa Aurora B, una proteína participante en el punto de comprobación del huso en metafase. Los
cromosomas de esta célula se encuentran adyacentes al huso mitótico, lo que sugiere la ausencia de
interacciones entre el cinetocoro y el microtubulo. (TOMADA DE CLAIRE DITCHFIELD ET AL., POR CORTESÍA DE STEPHEN S.
TAYLOR, J. CELL BIOL. 161:276, 2003; POR AUTORIZACIÓN DE DERECHOS DE THE ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS.)
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FIGURA 18-52 Formación de anticuerpos
monoclonales.
Los pasos se describen en el texto. El medio
HAT se llama así porque contiene hipoxantina,
aminopterina y timidina. Este medio permite
el crecimiento de las células con una
fosforribosiltransferasa de hipoxantinaguanina (HGPRT), pero no apoya el
crecimiento de células que carecen de esta
enzima, como las células de mieloma múltiple
sin fusionar que se usaron en este
procedimiento.
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