Detección de Estados
Neoplásicos y Pre-Neoplásicos
en Exámenes de rutina y
Biología Molecular
Francisco Gutiérrez C(1); Adolay Sobarzo E(1);Juan Luís Castillo N(2).
(1) Alumno carrera de Tecnología Médica, Universidad de Concepción.
(2) Tutor encargado del ramo Biología Molecular, Universidad de Concepción.
18/12/06
¿QUÉ ES EL CÁNCER?
Desequilibrio
Muerte
celular
Proliferación
celular
¿Qué es el cáncer?
Neoplasia Maligna
Clon celular
Descontrol Ciclo celular
Infiltración
Tumor
Metástasis
Evolución Natural del Cáncer
• Tejido Normal
• Hiperplasia
• Metaplasia
• Anaplasia
• Displasia
• Neoplasia
Génesis del cáncer
Mutaciones Acumuladas
Mutaciones Acumuladas
1. Continuidad de señales
positivas de proliferación por
activación de oncogenes.
4. Inmortalización atribuible a la
activación de la telomerasa.
2.Pérdida de señales negativas
de crecimiento por
inactivación de genes
supresores.
CÁNCER
5. Angiogénesis
sustentada por
? angiogénicos
factores
3. Escape de la apoptosis por
producción de factores de
sobrevida IGF
6. Alteración de las moléculas de
adhesión celular.
Genes Involucrados
Oncogenes
• Oncogen ras
• Oncogen c-myc
• Oncogen c-fos
Genes Involucrados
Supresores de Tumores
• Gen APC (poliposis
adenomatosa coli)
• Gen DDC (deleted in
cancer colorectal)
• Gen RB
Genes Involucrados
Reparadores del ADN
• Gen TP53
• Gen MSH-2
• Gen MLH-1
• Gen PMS-1 y PMS-2
Génesis del cáncer
Aneuploidía
Mutaciones Acumuladas
Teoría de Aneuploidía
“Propone que el cáncer es causado por la dosificación
anormal de miles de genes normales”
“Esta dosificación anormal de genes es generada por la
ganancia o pérdida de cromososmas específicos o
segmentos de cromosomas, o simplemente una pequeña
secuencia de ADN, alias aneuploidía”
Proc Natl Acad Sci USA 94:14506-11 (1997)
Biochem J 340:621-30 (1999)
Proc Natl Acad Sci USA 97:3236-4 (2000)
Cell Motil Cystoskel 47:81-107 (2000)
Cell cycle 2:202-10 (2003)
IUBMB life 56:65-81 (2004)
Nature Biotechnol 21:13-14 (2003)
GENES VII (Lewin B.)
¿Cuál es el origen de la aneuplodía?
Ganancia o pérdida cromosómica durante la
división celular:
• Espontánea
• Inducción química
Mutat Res. 410:3-79 (1998)
Biochem J. 340:621-30 (1999)
División normal V/S aneuploidía
49,9
50,1
División Normal
Aneuploidía
Teoría de la Aneuploidía
Aneuploidía al azar
Cell cycle 3:823-828 (2004)
Estado de Aneuplodía
Desestabiliza genes
y cromosomas
Des balance en
grupos de proteínas
que segregan,
sintetizan y reparan
cromosomas
Reordenamientos y
acortamientos cromosómicos
Near diploid (2n)
Baja inestabilidad
Near Aneuploid
Alta inestabilidad y
adaptabilidad
Near Triploid (3n)
Near tetraploid (4n)
Muerte celular por aneuplodía:
• Nulisomías
• Acortamientos
cromosómicos no viables
• Mutaciones letales
Aneuploidía
Célula no cancerosa
Bajo el límite para el cáncer
Aneuploidía
Célula cancerosa
Se alcanza o sobre pasa
el límite para el cáncer
(en forma gradual o
abrupta)
Cytometry 22:307-316 (1995)
Biochem J. 340:621-30 (1999)
Métodos de Detección
Métodos morfológicos
Patología
Muestra de
tejido del
paciente
Biología Molecular
Proteínas
Proteómica
Muestra de
tejido o muestra
de sangre del
paciente
Genómica
ADN
Chip del
gen
Detección por Morfología
Citología
http://www.mibiopsia.com/images/
CITOLOGIA.jpg
Histología
www.gyne.cz/fotogalerie/fotogalerieimages/otmucinous%20adenocarcinoma.jpg
InmunoHístoquímica
www2.udec.cl/~webpatologia/fotos/
cancer2/pages/page_3.html
Tsissue Microarrays
ww.zeiss.com/C12567BE00472A5C/G
raphikTitelIntern/TMA_Array/$File/TM
A_array_357.jpg
Detección por Biología
Molecular
Microarrays
ADNc fluorescente
ADN
Chip de gen
Microarreglo escaneado
Célula normal
Aislar a los ARNms
Producir ADNcs
fluorescentes
Añadir al microarreglo
de ADN
El rojo hace juego
No hace juego
El rojo hace juego
Microarreglo
escaneado
El ADNc fluorescente de la célula muscular “ilumina” al gen de miosina
Miocito
ARNm de miosina
ADNc fluorescente Microarreglo de ADN
Microarreglo
escaneado
+ transcriptasa
inversa
Miosina
El ADNc fluorescente del linfocito “ilumina” al gen de inmunoglobulina
Linfocito
ARNm de
inmunoglobulina
ADNc fluorescente Microarreglo de ADN
+ transcriptasa
inversa
Microarreglo
escaneado
Inmunoglobulina
Utilizando al ADN para Comparar
Células Cancerosas con Células Normales
Célula normal
Célula cancerosa
Aislar los
ARNms
Producir ADNcs
fluorescentes
rojos y verdes
Añadir al
microarreglo
de ADN
Ambos, rojos
y verdes
hacen juego
Ninguno
hace juego
Sólo los verdes
hacen juego
Microarreglo
escaneado
Sólo los rojos
hacen juego
Interpretando los Datos
Artwork by Jeanne Kelly. © 2002.
El gen del cáncer se expresó 18 veces más que el gen normal
Citometría de Flujo
Estudio de Ploidía de
ADN mediante
estudio del ciclo
celular de lesiones
pre-neoplasicas y
neoplasicas
ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN
Y CICLO CELULAR
• Se evalúa el contenido relativo de ADN en el
núcleo de una célula normal o neoplásica.
• Se obtiene una estimación de las fases del
ciclo celular.
• Se obtienen resultados de la cantidad de ADN
celular, lo que se traduce en discriminar
poblaciones diploides y aneuploides.
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
CONTENIDO ADN
CANTIDAD DE
ADN V/S TIEMPO
2X
1X
G1
S
G2
M
FASES CICLO CELULAR
G1
1 50
0
75
C o u n ts
2 25
300
DNA Análisis
0
200
400
2N
600
800
4N
PI Fluorescence
Purdue University Cytometry Laboratories
1000
300
DNA Análisis
225
DNA index 1.21
150
0
75
C o u n ts
Aneuploid peak
0
200
400
600
PI Fluorescence
Purdue University Cytometry Laboratories
800
1000
ESTUDIO DE PLOIDIA DE
ADN Y CICLO CELULAR
INDICE ADN (ID): Medición de Ploidia de
ADN.
ID:
Razón de la Cantidad de ADN de la
Muestra v/s el control.
ID =
Contenido ADN Células G0G1 Muestra
Contenido ADN Células G0G1 Control
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
ESTUDIO DE PLOIDIA DE
ADN Y CICLO CELULAR
INDICE ADN (ID): Medición de Ploidía de ADN
PLOIDIA
ADN Diploide
ADN Aneuploide
ADN Hiperdiploide
ADN Hipodiploide
INDICE ADN
=1
=1
>1
<1
Proteómica
• Entendida como una genómica funcional
• Biomarcadores
• Pautas terapéuticas
Electroforesis Bidimensional
Nuevos puntos
Puntos perdidos
http://www.upf.edu/cexs/sct/proteomi/img/ef2D.gif
Protein Chip
www.ipht-jena.de/BEREICH_3/bilder/protein_array.jpg
Espectrometría de Masa
Discusión
• Faltan mas estudios
comparativos entre
ambas teorías, motivo
por el cual se conoce
poco de Aneuploidía.
• Todas las neoplasias
presentan aneuploidía,
en contraste con
mutaciones
acumuladas.
• Existen estudios que
desprecian la teoría de
la Aneuploidía como
causa común en
neoplasias de
Adenocarcinoma
esofágico(1).
• La aneuploidía es una
consecuencia de
inestabilidad genómica
de las mutaciones
acumuladas.
(1)www.academia.cat/societats/digest/5curs/esofag.htm
Discusión
• Las técnicas de
genómica, detectan
los problemas a
nivel de Ac.
Nucleicos, lo que
posibilita un
diagnóstico
oportuno y a la raíz
misma de éste.
• Las técnicas
proteómicas
detectan el
resultado de todo el
proceso de
expresión génica
(inclusive los
factores
epigenéticos),
siendo más efectivo
y fácil de dilucidar.
Conclusión
La displasia es un
• Los diagnósticos
concepto en el que ni
morfológicos se
los propios morfologos
hacen cada vez más
están de acuerdo, por lo
incompletos sin
que las técnicas de
técnicas
biología molecular son
complementarias que
la futura solución a este
determinen más
dilema.
certeramente el
pronóstico de la
neoplasia.
Conclusión
•
Es importante
poder identificar
cual técnica es la
mas ideal para
poder diagnosticar
una neoplasia en
particular,
considerando que
en un futuro se
harán tratamientos
personalizados.
• A futuro, la detección
de estados
neoplásicos y preneoplásicos serán
diagnósticados de
forma predictiva en
base a la proteómica y
genómica,
identificando
tempránamente el
cáncer.
Agradecimientos
•
Profesor Juan Luís Castillo N.
•
Dr. Marcelo Larremendi.
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