Efecto de iones en la Pirazinamidasa
recombinante de la cepa H37Rv de
Mycobaterium tuberculosis
Patricia Ferrer
H37Rv
Pirazinamida
Pirazinamidasa
Modo de acción
Clonación, expresión y purificación
Quelación
Reactivación
enzimática con
iones solos
Reactivación
enzimática en
combinación iónica
Parámetros
cinéticos
Marco general
¿Qué es la pirazinamida?
pirazinamida
≈
nicotinamida
Reducción del tratamiento de la TB de 9 a 6 meses
Marco general
Modo de acción de la Pirazinamida
* No tiene un blanco
específico intracelular
*Pseudo-NAD (vía de
reciclaje)
*Inhibición/feedback
en síntesis de NAD
Disrupción de la fuerza
protón motriz y
depleción de energía
Función de
transporte de
membrana
Marco general
Pirazinamidasa de Mycobacterium tuberculosis
• Nicotinamidasa
• 37% de identidad de seq
con Pzase de Pyrococcus
horikoshii 999
• 6 hojas beta
• 4 alfa hélices
• Sitio activo: D8, A134,
C138
• Sitio de coordinación:
H51, H71, D49
Marco general
Diagrama del sitio activo unido al Zn+2 (en PH999)
Marco general
Mecanismo de hidrólisis de PZA por la PZAsa de
Mycobacterium tuberculosis
Hipótesis
La enzima H37Rv de Mycobaterium tuberculosis quelada, podría
reactivarse e incluso llegar a aumentar su actividad en presencia del
Zn+2 o de algún metal de transición gracias a su unión en el sitio de
coordinación.
Objetivos
• Encontrar el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima
H37Rv de Mycobaterium tuberculosis quelada.
• Evaluar las consecuencias sobre la actividad enzimática frente a una
interacción iónica en una misma reacción
• Determinar los parámetros cinéticos de la enzima H37Rv sin quelar
(dejada a temperatura ambiente por 6 horas)
• Comparar los parámetros cinéticos de la enzima H37Rv quelada junto
con los iones vs la enzima sin quelar
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Clonación y expresión
pET28a:: His6-PncA (se adicionan 6 His al extremo COOde la enzima)
Escherichia coli Novablue cells
expresión
BL21(DE3)pLysS cells
Centrifugar
IPTG
Caldo LB + Kanamicina
Pellet en binding buffer (buffer fosfato 20mM. 0.5 NaCl, imidazol 20mM)
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Purificación de la enzima
Obtención del extracto crudo
Cromatografía de afinidad
Fracción soluble
Células a -70ºC
Columna
His-Trap
Sonicación
Centrifugación
Lavados con buffer 40 mM imidazol
Salida de la Pzasa con buffer 60 mM imidazol
Recuperación del
sobrenadante
Análisis de fracciones por SDS-PAGE
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Purificación de la enzima
Gel de las fracciones
de la cromatografía
SDS-PAGE
T10
T11
T12
T13
T14
M
T15
T16
Concentración de
fracciones
Nuevo SDS-PAGE
Prueba de
Bradford
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Quelación
Pzase H37Rv
En
incubación
por 6 horas
a T amb
Control
Muestra
quelada (qx)
* 50mM Buffer fosfato pH 6.45
* 50mM Buffer fosfato pH 6.45
* Agua MQ
* Agua MQ
* EDTA 80 mM
Lavar con buffer fosfato pH 6.45 (filtración, Amicon - membrana
de ultrafiltración de 10 Kda) x 3 veces
Prueba de Bradford
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Prueba de actividad cualitativa (método de Wayne)
Enzima control y
quelada (qx)
Incubación por
3 min a 37ºC
50 mM Buffer fosfato pH 6.45
Pirazinamida 20 mM
Agua MQ
Añadir sulfato de
amonio ferroso 20%
Inmediatamente añadir
0.1M Buffer glicina pH 3.4
Diferencia en intensidad de color
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Control
Muestra Quelada
Enzima 3uM
Enzima 3uM
50mM Buffer fosfato pH6.4
50mM Buffer fosfato pH6.4
Agua MQ
Agua MQ
20mM PZA
20mM PZA
----
Con o sin ión (0.1-1.5mM) **
** según el metal
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Iones
Fe2(SO4)3.H2O
FeSO4.7H2O
CuCl2.2H2O
Concentración
óptima de cada
metal
Cd(NO3)2.4H2O
MgSO4.7H2O
CoSO4.7H2O
MnSO4.H2O
CaCl2
Zn (NO3) 2 .6H2O
Titulación
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
blanco
control
qx sin
ión
qx- Cd
qx- Ca
qx- Co
qx- Cu
qx-F e+2
qx- Fe+3
qx-Mg
qx-Mn
qx-Zn
-----
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Buf.PO4
X
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Agua
MQ
X
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
-----
-----
-----
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Pzasa
ión
Pza
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
blanco
control
qx sin
ión
qx- Cd
qx- Ca
qx- Co
qx- Cu
qx-F e+2
qx- Fe+3
qx-Mg
qx-Mn
qx-Zn
1. Añadir sólo enzima, agua, buffer e ión (según el caso)
2. Incubar las muestras por 30 minutos a 37ºC
3. Añadir la Pza e incubar las muestras por 3 minutos a 37ºC
4. Agregar sulfato de amonio ferroso e inmediatamente buffer glicina pH 3.4
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
blanco
control
qx sin
ión
qx- Cd
qx- Ca
qx- Co
qx- Cu
qx-F e+2
qx- Fe+3
qx-Mg
qx-Mn
qx-Zn
Tiempo
Pza
T=0
T=1
T=2
T=3
T=4
T=5
T=6
T=7
T=8
T=9
T = 10
T = 11
Tiempo
de
detener
la rxn
T=3
T=4
T=5
T=6
T=7
T=8
T=9
T = 10
T = 11
T = 12
T = 13
T = 14
Tiempo
de rxn
/tubo
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
4. Agregar sulfato de amonio ferroso e inmediatamente buffer glicina pH 3.4
5. Centrifugar las muestras por 10 minutos a 13 000 RPM
6. Colocar por duplicado un volumen de cada muestra en un
placa (espectrofotómetro a 450nm)
Prueba de actividad cuantitativa (método de Wayne)
7. Realizar prueba de Bradford de cada una de las muestras/rxn
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Actividad Pzasa
1er experimento
2do experimento
3er experimento
promedio
0.018
0.0143
0.016
Actividad (OD/uM*min)
0.014
0.012
0.0105
0.0097
0.010
0.008
0.006
0.0041
0.0032
0.004
0.002
0.0004
0.0006
0.0004
0.0004
0.0003
Fe2+
Fe3+
0.0007
0.000
no qx
qx sin ion
Ca
Cd
Co
Cu
Mg
Mn
Zn
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
% de Recuperación de actividad enzimática
150.00
1er experimento
3er experimento
137.43
140.00
2do experimento
promedio
130.00
120.00
110.00
100.00
92.39
90.00
%
80.00
70.00
60.00
50.00
37.17
40.00
27.24
30.00
20.00
10.00
2.40
0.08
0.00
-0.28
Fe2+
Fe3+
3.32
0.00
-10.00
Ca
Cd
Co
Cu
Mg
Mn
Zn
% recuperación = (Act con metal - actividad qx sin ión) / ( actividad de no qx – actividad qx sin ión) x 100
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
% de Recuperación de actividad enzimática
150.00
1er experimento
3er experimento
137.43
140.00
2do experimento
promedio
130.00
120.00
110.00
100.00
92.39
90.00
%
80.00
70.00
60.00
50.00
37.17
40.00
27.24
30.00
20.00
10.00
2.40
0.08
0.00
-0.28
Fe2+
Fe3+
3.32
0.00
-10.00
Ca
Cd
Co
Cu
Mg
Mn
Zn
Los metales que reactivan más a la enzima: Co > Mn > Zn > Cd
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
Reactivación de la Pzasa con 6 combinaciones posibles a partir de 4
iones
blanco
control
qx sin
ión
Qx
Cd+Mn
Qx
Co+Zn
Qx
Co+Cd
Qx
Mn+Zn
Qx
Mn+Cd
qx
Zn+Cd
Qx-Co
Qx-Mn
Qx-Zn
Pirazinamidasa
Agua MQ
Pirazinamida
----
----
----
[óptima de ión] / 2 **
** [óptima] de ión
** [ión] en el experimento
Co, Mn, Cd = 1mM
Co, Mn, Cd = 0.5mM
Zn = 1.5 mM
Zn = 0.75 mM
Qx-Cd
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
Reactivación de la Pzasa con 6 combinaciones posibles a partir de 4
iones
Actividad Pzasa
1er experimento
2do experimento
3er experiemento
promedio
0.020
0.0161
0.018
0.0154
Actividad (OD/uM*min)
0.016
0.014
0.0123
0.012
0.0099
0.0087
0.010
0.0092
0.0073
0.008
0.0041
0.006
0.0050
0.0039
0.0011
0.004
0.0004
0.002
0.000
noqx
qx sin ion
Co + Cd
Co + Mn
Co + Zn
Mn + Cd
Mn + Zn
Zn + Cd
Co
Mn
Zn
Cd
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
Reactivación de la Pzasa con 6 combinaciones posibles a partir de 4
iones
Por lo tanto:
• No habría sinergismo en ningún caso
• La interacción produciría en cambio una disminución de la
actividad o se manifestaría como si se tratara del ión sólo
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática:
Co+2 >>>Mn, Zn, Cd ???
ENZYME - The Enzyme Data Bank
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática:
Co+2 >>> Mn, Zn, Cd???
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática:
Co+2 >>> Mn, Zn, Cd ???
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática:
Co+2 >>> Mn, Zn, Cd ???
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
Habrá alguna relación entre la homeostasis iónica y el parasitismo
intracelular?
X+2 = Fe+2, Cu+2, Mn+2, Zn+2
Nramp2 homólogo de
rata
Simporter potones/cationes
divalentes de amplia
especificidad
Fe+2 >> Zn+2, Mn+2, Cu+2,
Co+2, Ni+2, Cd+2, Pb+2
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática
Kcat = nº de recambio
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática de la H37Rv control
[Pza]
mM
0
0.05
0.10
0.15
0.25
0.50
1
2
5
Pirazinamidasa
Buffer fosfato pH 6,4
Agua MQ
Incubación por 2 min a 37ºC
Intervalo de adición de la droga 1 min
Tiempo de reacción con la droga 1 minuto a 37ºC
10
15
20
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática de la H37Rv control
Velocidad vs [sustrato]
0.120
1er experimento
0.100
0.080
0.060
0.040
0.020
0.000
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
[sustrato uM]
Velocidad vs [sustrato]
0.180
0.160
2do experimento
Velocidad(umol/min)
Velocidad (umol/min)
0.140
0.140
0.120
0.100
0.080
0.060
0.040
0.020
0.000
-0.0200.000
0.500
1.000
1.500
[sustrato uM]
2.000
2.500
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática de la H37Rv control
1er experimento
y = 0.8186x + 5.8342
R2 = 0.9985
Linew eaver-Burke
180.000
1/Velocidad (min/umol)
160.000
140.000
120.000
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0.000
-2.000
48.000
98.000
148.000
1/PZA (1/um ol)
198.000
248.000
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática de la H37Rv control
2do experimento
Lineweaver-Burke
y = 1.2098x + 6.1112
R2 = 0.9935
100.000
1/Velocidad (min/umol)
90.000
80.000
70.000
60.000
50.000
40.000
30.000
20.000
10.000
0.000
-2.000
48.000
1/PZA (1/umol)
98.000
Marco general
Acción de la pirazinamidasa
Marco general
Metabolismo de NAD
Nicotinamidenucleotide
adenylyltransferase
NAD(+) synthase
NAD -glycohydrolase
phosphorilase
Nicotinamidase
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Método de Wayne
Buffer glicina pH 3.4
Sulfato de
amonio ferroso
¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Titulación: ej del Fe+2, del Mn+2 y del Zn+2
Titulación Fe+2
Actividad (OD/uM*min)
0.016
0.014
0.012
0.010
1er experimento
0.008
2do experimento
0.006
0.004
0.002
0.000
no
quelada
qxsinion
0.01
0.05
0.1
0.25
0.5
0.75
1
¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Titulación: ej del Fe+2, del Mn+2 y del Zn+2
Actividad (OD/uM*min)
Titulación Manganeso
0.020
0.018
0.016
0.014
0.012
0.010
0.008
0.006
0.004
0.002
0.000
1er experimento
2do experimento
no qx qx sin 0.01
ion
0.05
0.1
0.25
0.5
0.75
1
1.5
2
¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Titulación: ej del Fe+2, del Mn+2 y del Zn+2
Titulación Zinc
Actividad (OD/uM*min)
0.030
0.025
0.020
1er experimento
0.015
2do experimento
0.010
0.005
0.000
no qx
qx sin
ion
0.01
0.05
0.1
1
1.5
2
¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Iones
[final en la rxn] mM
Fe2(SO4)3.H2O
0.1
FeSO4.7H2O
0.1
CuCl2.2H2O
0.1
Cd(NO3)2.4H2O
1
MgSO4.7H2O
1
CoSO4.7H2O
1
MnSO4.H2O
1
CaCl2
1
Zn (NO3) 2 .6H2O
1.5
¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Actividad
No qx
d
Qx sin ión
Ión1
Ión2
Enz qx + iones
Ión3
% rec = d /
x 100
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Efecto de metales en la enzima recombinante H37Rv de