Ejemplo de un “insulator” con efecto
barrera y bloqueador de enhancer
Ejemplo de “insulator” con efecto de barrera
Ejemplo de un “insulator” con efecto
bloqueador de enhancer
Ensayo para medir la actividad bloqueante de enhancer
Construcción para medir efecto barrera
Analysis of the vertebrate insulator protein CTCF binding sites in the human genome Cell. 2007 March 23; 128(6): 1231
ENCODE: encyclopedia of DNA elements
Fibroblastos humanos- ChIP-chip contra CTCF
Se encontraron 14000 sitios de binding CTCF.
Comparación de los sitios de binding a CTCF en dos tipos de células
Distancias de los sitios CTCF a los extremos 5’ de genes
Objetivo: estudiar la regulación epigenética del locus de las apolipoproteínas
ApoA1, ApoA4 y ApoA5 constituyentes HDL-
ApoA3, constituyende VLDL
Antecedentes:
● Experimentos de ChIP-chip encontraron unos 14000 sitios de unión a CTCF en el genoma
humano
. ● Muchos sitios CTCF se corresponden con el enriquecimiento en complejos de cohesina
(RAD21), que median la cohesion de cromátidas hermanas en mitosis
● No se estudió si hay correlacion entre cohesina y CTCF en la actividad de los insulators
Distribucion de sitios enriquecidos en CTCF/Rad21 en el locus Apo
ChIP-chip en líneas celulares humanas
Verificación por ChIP
comprobación in vitro por gel shift
Conclusión: hay tres sitios de unión a CTCF : AC1, AC2, AC3
(que unen tambien Rad21, y un sitio AR1 que si bien tiene
secuencia de cierto renocimiento a CTCF no lo une, pero si une
Rad21
Comprobación de la actividad bloqueante de enhancers de los AC1. AC2, AC3 y AR1
Conclusión: los AC son aislantes
funcionales
1)
Bloquean un 40-60% la acción del
enhancer C3 en una respuesta
independiente de la orientacion
2)
Su efecto es mediado por la unión
de CTCF
3)
Se descarta que tengan efecto de
silenciador
AR1 tiene un efecto bloqueante
moderado
Efecto de HNFa sobre el enhancer y promotor de ApoA4
-HNFa: principal regulador transcripcional hígado
- produce activación a traves del promotor y del C3E
- ChIP demuestra que está unido tanto al promotor
como al C3E
La expresión de HNFa en HeLa promueve la expresión de los genes
APOA1/C3/A4/A5 y no la de los tres genes vecinos
Por ChIP se demuestra que se une a los 4 promotores y al enhancer
Por lo tanto los elementos AC2 y AC3 actúan como aislantes
CTCF y cohesinas están involucrados en el control transcripcional de la región APO
Células Hep3B: tratadas o no con siRNA contra CTCF o Rad21. Medición de niveles de mRNA de cada gen
por RT-PCR
Conclusiones: la deleción de CTCF/Rad21 afecta diferencialmente los genes dentro de AC2 y AR1 y los que
estan fuera de esa región
CTCT y cohesinas y conformación cromosomal de la región APO del cromosoma
Metodología: 3C, framentos BglII; frecuencia de ligación con el enhancer APOC3
CTCT y cohesinas y conformación cromosomal de la región APO del cromosoma
Conclusión: los aislantes dependientes de
CTCF y cohesinas mantienen la
conformación global del locus APO
Localización espacial del locus
3C más resolutiva para resolver
entre interacciones insulatorpromotor; promotor-promotor,
insulator-insulator
Se usa otra enzima de restriccion
MflI
Modelos para la actividad bloqueante de enhancers de los “insulators”
Un balance de actividades determina el limite de propagación de la cromatina
Mecanismo simplificado al mecanismo de propagación y
de automantenimiento de la heterocromatina en S.pombe
Distribución de Swi6, H3-K9 met o H3-K4 met en el locus Mat al delecionar
los elementos aislantes
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