Heparan Sulfate Proteoglycans as Regulators of Fibroblast Growth
Factor-2 Signaling in Brain Endothelial Cells
SPECIFIC ROLE FOR GLYPICAN-1 IN GLIOMA ANGIOGENESIS*
Dianhua Qiao, Kristy Meyer, Christoph Mundhenke‡, Sally A. Drew, and Andreas Friedl§
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278, No. 18, Issue of May 2, pp. 16045–
16053, 2003
Abreviaciones utilizadas:
FGF2, fibroblast growth factor-2;
FGFR, fibroblast growth factor receptor;
HS, heparan sulfate;
HSPG,heparan sulfate proteoglycan;
vWF, von Willebrand factor;
MBE,mouse brain endothelial;
HMVEC, human microvascular endothelialcell;
BrdUrd, bromodeoxyuridine;
AP, alkaline phosphatase;
VEGF,vascular endothelial growth factor.
FIG.1.Requerimiento de HS para la senalización de FGF2 en cells
endoteliales.
Cloruro
24 hs sin suero
FGF-2
Sulfato
Heparina
Cells
murinas
BrdU
Incorporac.
BrdU
Ensayo
colorimetrico
sin
Cloruro
24 hs sin suero
FGF-2
Sulfato
Heparina
Cells
bovinas
Sonicado
sin
Plasminógeno +
Sustrato cromogénico
Medición Absorbancia
Fig.2A.Medición expresión HPGs en
diferentes tipos de cells endoteliales
Extracción de HSPGs
Tratamiento enzimático(Condroitinasa y Heparitinasa)
para remover glucosaminoglicanos(GAGs)
Análisis en gel SDS-gradiente de poliacrilamida
3%-15%
Revelado Ab-anti HS
(calles 1-4)
Revelado Ab-anti proteínas
Core (calles 5-9)
Fig.2B. Función de HSPGs como co-estimuladores
de FGF-2
Aislan HSPGs de cells MBE
HSPGs
Biotina
Sobrenadante
Eluido
(NaCl 2M)
Concentración en bolitas DEAE
SDS-PAGE
Revelado con Ab-anti HS
Fig. 2C. HSPGs promueven la unión de FGF-2
a FGFR1
HSPGs(MBE) + FGFR1-Agarosa + FGF2
Lavado c/NaCl
(0.6-1-1.4 M)
Gel Gradiente
(3-15% )
Revelado Ab-anti HS
Controles (-)
•
•
Digestión HSPGs con
heparitinasa previo a
la formación del complejo
(linea 2)
Omisión de FGF-2
(linea 3)
FIG.3. Actividad de diferentes HSPGs de cells endoteliales de cerebro
como promotores de señalización por FGF2.
Cell Associated (Lisado de cells)
72 hs
Cells MBE
LISIS
Lavados
MEC
Extracción
con buffer
Columna DEAE
(enriquecimiento de HSPGs)
Extracción selectiva de HSPGs
Hep´asa
Fig 3A
Dot blotting
(cuantificación con Ab 3G10)
Fig 3B
FIG.4. Reconstitución in situ del complejo FGF2-HSPG-FGFR1.
Lavados
Ab AP
FR1-AP
Tejido
Ab 2rio ( )
FIG.5. Detección inmunohistoquimca de los core protéicos de
HSPG en cortes parafinados.
FIG.6.Detección de core protéicos de HSPG en tejidos humanos de
glioma y cerebro normal por inmunofluorescencia.
Fig.7. Sobreexpresión de Glipican-1 promueve crecimiento y sensibiliza
la estimulación de cells endoteliales por FGF-2
Transfección
con Glipican-1
+ FGF-2
Medición incorporación BrdU
Cells MBE
Transfección
Mock
Extracción HSPGs
SDS-PAGE
Revelado Ab-anti HS
Conclusiones
• Para que FGF2 estimule la proliferación de cells endoteliales es necesario la presencia de HS (Fig.1)
• Las HSPGs de superficie de membrana predominantes son Sindecan-2 y -4 de las cells endoteliales
examinadas, mientras que Sindecan-1 y –3 y Glipican-1 representan una fracción menor de HSPGs en
algunos tipos cells, e indetectables en otros (Fig.2A).
• Todos los core proteicos de los HSPGs analizados poseen cadenas de HS a las cuales se pega FGF2.
Éstas, promueven la unión de FGF2 al receptor FGFR1c (Fig.2B y 2C).
• Los HSPGs son capaces de formar un complejo que es funcional (capaz de desencadenar una señal) en
experimentos in vitro (Fig.3).
• Existe una alteración cualitativa o cuantitativa de los HSPGs en los vasos de glioma, evidenciado por la
reconstitución in situ del complejo ternario (Fig.4).
• El contenido total de HSPG en vasos de glioma se haya incrementado respecto de vasos normales
(Fig. 5A/B), siendo Glipican-1 el de mayor sobreexpresión en tejidos tumorales (Fig.5 E/F).
• Cortes de glioma y tejidos normales revelaron por inmunofluorescencia la sobreexpresión de Glipican-1 y
su co-localización en cells endoteliales (Fig.6).
• Los resultados sugieren un rol específico de Glipican-1 en el crecimiento endotelial y de la mitogénesis
inducida por FGF2 en procesos angiogénicos. El aumento en la síntesis de Glipican-1 en cells endoteliales
permitiría una sensibilidad local mayor al factor de crecimiento, llevando a la reconstitución del tejido
dañado en procesos normales, mientras que el mismo mecanismo favorecería la radiación de tejidos
tumorales.
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