Bibliotecas
TEJIDO
mRNA
VECTORES
DNA
cDNA
DNA digerido
(doble cadena metilado)
DNA CLONABLE
LIGACION DNA-VECTOR
DNA RECOMBINANTE
INTRODUCCION EN CELULA HUESPED
LIBRARY
cDNA o genómica
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Bibliotecas cDNA BM 2009
Estrategia general construcción biblioteca de expresión
Paso 1
Paso 2
Paso 3
Paso 4
Paso 5
Paso 6
Paso 7
Paso 9
(if necessary)
Paso 8
Vectores usados:
lgt10
lgt11
lZAP
lTriplEx
Paso 10
2
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Pasos 1 y 2: Fuente y purificación del mRNA
•Fuente de mRNA:
Preparación de poliA+ mRNA
Alta relación secuencia interés/ mRNA total.
Baja tasa de degradación.
•Métodos de enriquecimiento:
Uso de drogas para selección de líneas celulares
o estímulos específicos.
Fraccionamiento del mRNA o cDNA.
Clonado sustractivo.
T T T(30)
3´A A A
5´
3
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Paso 3: Síntesis de la primera cadena de cDNA
Transcriptasas reversas (RT): DNA pol RNA dependiente
ALV (Avian leukemia virus) y MoMLV (Moloney strain of murine leukemia virus)
Random primers
Oligo dT
5´cap
5´cap
AAA(A)nA 3´
AAAAAA(A)nA 3´
mRNA
mRNA
Random primers
TTTTTT(n)T
AAAAAA(A)nA
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
Transcriptasa reversa
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
AAA(A)nA
Transcriptasa reversa
AAA(A)nA
AAAAAA(A)nA
AAA(A)nA
AAAAAA(A)nA
cDNA:mRNA
cDNA:mRNA
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Paso 4: Síntesis de la segunda cadena de cDNA
Por reemplazo
Transferasa terminal
AAAAAA(A)nA
AAAAAA(A)nA
dNTPs
RNAasa H: nicks mRNA en mRNA:DNA
RT con oligo dT
DNA pol
TTTTTTTTTT
AAAAAA(A)nA
Degradación RNA
TTTTTTTTTT
Transferasa terminal
dCTP
CCCCC
TTTTTTTTTT
Fragmento Klenow
dNTP´s + oligo G
cDNA doble cadena
GGGGG
CCCCC
AAAAAAAAA
TTTTTTTTTT
cDNA doble cadena
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Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado. Uso de adaptadores.
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Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Oligo dT-primer adaptador.
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Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación. Uso de adaptadores.
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Fosforilación de los fragmentos antes de ligar al vector
Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3 y 4: Síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA
Esquema para la construcción de una biblioteca full-length
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Fago l: Mapa génico
Brazo izquierdo
Cos
Región central
Brazo derecho
Cos
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Fago l: Ciclo de vida
Activates
C2 protein
Alta [C1]
Baja [C1]
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Fago l
Formación placas de lisis
Ensamblado del bacteriófago
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Construcción de vectores l
Vectores: dejaron el 60 % del genoma l salvaje (crecimiento lítico)
Tamaños que se empaquetan eficientemente: 105-78 % del genoma (10-20 kpb)
Elección del vector:
• ER empleada.
•Tamaño del fragmento a ser insertado.
•Expresión del cDNA en bacterias.
•cDNA debe ser “rescatado” del vector l en forma de plásmido.
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Pasos 7 y 8: Esquema preparación biblioteca en vectores derivados de fago l
Ligación
Selección-Screening
Vector desfosforilado
Relación molar alta [Vector / inserto]
Extremos no compatibles
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l gt10: 5-11 kb
gen CI
Marcador de selección
de fagos recombinantes: CI
CI
Lisogenia
Esquema:
lgt10-EcoRI
cDNA- EcoRI
CI
Lisis
Cepas E. coli hfl – (mutantes proteasa Hfl)
NO degrada CII
S! CI
lisogenia
Ligación
Empaquetamiento in vitro
Fagos CI D forman placas de lisis en cepas hfl-
Infección E. coli hflPlaqueo en top agar
Formación placas de lisis
(amplificación)
Screening hibridización sondas
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Plaqueo en top agar y
formación placas de lisis
Screening biblioteca:
Hibridización con sondas
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EcoRI
l gt11: 7 kb
plac
lacZ
Inserción cDNA en EcoRI
Proteína de fusión
CI 857: mutante inactivo del represor a 45ºC
S 100: mutación ambar en el gen S lisis
Screening biblioteca de expresión: Inmunodetección
Infección cepa E. coli SupF
Incubación 10-15´ a 45ºC
Inducción ciclo lítico
Esquema:
lgt11-EcoRI
cDNA- EcoRI
Ligación
Empaquetamiento in vitro
Infección E. coli
Plaqueo en top agar. Incubación a 42ºC
Formación placas de lisis
Screening inmunodetecciónHibridización sondas
Screening recombinantes
IPTG/X-gal
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l ZAP: 7 kb
Esquema:
lZAP (EcoRI/XhoI)
pBluescript SK-
cDNA (EcoRI/XhoI)
Ligación
Empaquetamiento in vitro
Infección E. coli
Plaqueo en top agar
Formación placas de lisis
Screening inmunodetección
Clones positivos
Recuperación de los clones positivos:
Clon l recombinante positivo
+ M13 fago helper mutante
XhoI
EcoRI
T
I
XL1-blue MRF´ SupE
SupE- lR
LB-Amp
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l TriplEx: expresión en tres marcos de lectura
Ribosome Binding Site (RBS)
Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG
mRNA
UAAGGAGG
AUUCCUCC
5’
3’
AUG
3’
5’
16S rRNA small ribosomal subunit
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Pasos 9 y 10: Screening e identificación de los clones.
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