Microarray Identification de
FMRP- Associated Bian mRNAs
and Altered mRNA Traslational
Profiles in Fraglie X Sindrome.
Introducción.

El sindrome de Fragil X es una causa comun del retraso
mental, el cual se debe a una deficiencia en l proteina
FMRP.
-Fragile X Mental Retardation Protein-.
FMR1
FMRP
Gen ligado al
Cromosoma X.
(CGG)n
FMR1
lidera el silenciamiento transcripcional del gen

FMR1 y sus paralogos autosomicos FXR! Y FXR2 codifican
proteinas de union al ADN.
Comparten 60% de su identidad de aa.
FMRP
Se une a RNA homopolimerico
(poly A).
Se une a un subset de ARN proveniente
del cerebro.
Citoplasmatica: incrporada dentro de un complejo
ribonucleoproteico unido a un mensajero – FMRP- mRNP
Purificada posee capacidad intrinseca de union al RNA.
El complejo FMRP-mRNP esta asociado con poliribosomas
traduccionales.
FMRP


Una MUTACIÓN sin sentido en el
segundo dominio KH de FMRP (1304N)
que tiene como resultado un fenotipo
grave de sindrome genera la incapacidad
para la asociación con lo polirribosomas.
Hipótesis: Cuando FMRP está ausente
los mRNA normalmente asociados con el
complejo FMRP-mRNP podrían verse
desregulados traduccionalmente; lo cual
llevaría a deficiencias cognitivas en el
cerebro.
Objetivos:
Microarrays
Identificación de mRNA
asociados al complejo
FMRP-mRNP en cerebro
de ratón.
Identificación de mRNA de cel
humanas con el síndrome, que
polirribosomas anormales por la
ausencia de FMRP
Se obtendrá un subset de ARNm que se asocian a
FMRP- mRNP in vivo que poseen pefil polirribosómico
anormal.
Inmunoprecipitación
Resultados:

Aislamiento e identificación de mRNAs
asociados con FMRP conteniendo partículas
de mRNP.
Estrategia: inmunoprecipitar especificamente FMRP
conteniendo partículas de mRNP e
identificar los mRN
coinmunoprecipitados usando
microarrays.
Inmunoprecipitación del complejo FMRP-mRNP.
A- Analisis de Western blot competitivo. Testear el
anticuerpo
Para FMRP de ratón, se utilizan anticuerpos monoclonales (mAb
7G1.1) por inmunización de ratones knockout Fmr1 con FMRP. El
epítope reconocido fue mapeado en una región de no homología
con las proteínas Fxr1 y Fxr2.
Inmunoprecipitación del complejo FMRP-mRNP.
A- Anlisis de Western blot competitivo. Testear el anticuerpo
Western blot obtenido de SDS PAGE 7.5%
IP de FMRP con mAb7G1-1: Ig: Ac, none: nada, M2: proteína inerte, 7G1-1#1:
péptido específico. Revelado con Ac 1C3
Inmunopresipitación de complejos
FMRP-mRNP
B- Inmunoprecipitacion con mAb 7G1-1 y probadoo con anti- anticuerpo
C13.
Este Ac inmunopresipita
al menos tres isoformas
de FMRP.
KO: no presenta FMRP
a: isoformas
d: Ac
lysate: lisado total
flow thru: lo que queda
luego de IP.
Western blot para Parálogos FXR2P y FXR1P revelados con: a: antiFMRP
(1C3), b: antiFXR2P (A42), c: antiFxr1, d: Ig.
Extracción de RNA,
obtención de cDNA y
visualizado por
autorradiografía.Observación
de ARN poly A.
•
•
•
•
•
•
•
Permiten analizar simultáneamente
la expresión de genes.
La técnica consiste en fijar miles de
fragmentos de DNA ordenados, a
una superficie sólida, generalmente
de cristal.
Cada secuencia corresponde a un
gen diferente.
El mARN es tomado de una célula
o tejido particular, se realiza RTPCR y se marca para generar una
muestra etiquetada. Esta muestra
es “hibridizada” sobre los “probes”
del microarreglo.
La muestra marcada se encontrará
con su secuencia complementaria.
La cuantificación de la expresión
génica se da por el procesamiento
de las imágenes obtenidas de los
microarreglos.
Se puede utilizar mas de un
fluorocromo para distintas muestras
Microarreglos
excitation
scanning
cDNA clones
(probes)
laser 2
PCR product amplification
purification
printing
laser 1
emission
mRNA target)
overlay images and normalise
0.1nl/spot
Hybridise target to microarray
microarray
analysis
Análisis de los ARNm residentes en
el complejo FMRP-RNPm por
microarreglos



Se utilizaron matrices de oligonucleótidos,
Affimetrix Murine Genome (MG-U74) y Murine
19K (MU19k).
Se prepararon lisados de wt y KO. Del 20% se
aisló el ARN total (imput-RNA) y al resto se le
resalizó una imnunoprecipitación con 7G11mAb,y se aisló el ARN del precipitado (ARN-IP)
Se generaron ARNc de las muestras de wt-ARNIP, KO-ARN-IP y ARN-imput, y fueron hibridadas
en paralelo con MG-U74.
Análisis de los ARNm residentes en el
complejo FMRP-RNPm por microarreglos
La identificación de los ARNm
coinmunopresipitados con
el complejo FMRP-ARNm
se realizó mediante
microarreglos de
oligonucleótidos de
“Affymetrix Murine Genome
U74” (MG-U74) y “Murine
19K” (Mu19K). Se
analizaron 25181 ARNs del
la base de datos UniGene
y 19021 mensajes de la
base de datos TIGR.
Input: chip MG-U74 hibridizado con ARNc
generado del ARN total de lisado wt
WT-IP: wt ARN coIP con FMRP
KO-IP: ARN IP de Fmr-1 KO.




ARN-imput muestra fluorescencia intensa
Menos del 0.05% del ARN total cambió al
comparar wt vs KO (no mostrado)
En wt-IP se vé pérdida sustancial de
intensidad
En KO-IP hay mayor pérdida. Las señales
probablemente se debieron a interacciones
de fondo con la matriz de anticuerpos
independientes de FMRP



De 25181 genes de la matriz, 11064 (44%)
estaba presente en wt-imput
Se comparó el perfil de ARN-wt-IP con el perfil
del ARN-KO-IP, y luego el perfil de ARN-wt-IP
con el perfil del ARN-imput.
Primero se identifica los ARN independientes de
FMRP, asociados con la matriz de anticuerpos y
luego se identifica los ARNm presentes en el wtIP relativos al wt-imput, descartando los que
tengan alta abundancia en el wt-imput, ya que
podría ser responsable de su presencia en el wtIP.
Análisis de los ARNs
coinmunopresipitados con
FMRP-mRNP
La intersección de
432 (3.9%)
sugiere que casi
el 4% de los
mensajeros se
encuentran
asociados a
FMRP.
Diagrama de Venn de los ARNs asociados con el
complejo FMRP-ARNm
Cuadro: genes disponibles en el MG-U74
Blanco: genes detectados en el lisado total wt.
Rojo: genes enriquecidos (4 veces o más) en el wt-IP
comparado con el KO-IP.
Verde: genes enriquecidos en el wt-IP versus el lisado
total.
Amarillo: genes enriquecidos en el wt-IP en ambos
casos.
RNAs mensajeros asociados con
Fmrp-mRNP en cerebro de ratón.
En la tabla 1 se muestran
los 80 ARNm mas
enriquecidos. El orden se
estableció se por la
suma: (wt-IP versus KOIP) + (KO-IP versus
input). El mayor
enriquecimiento fue para
el ARNm KIAA0763
relacionado con Sec7,
identificado por
homología como el
factor intercambiador
del nucleótido de
guanina.




Se realizó otro experimento independiente
de IP que se analizó en la matriz MU19K
Usando los mismos criterios de
comparación:
36 de 80 genes no estaban en la matriz
Se confirmó el enriquecimiento para 28 de
los 44 que sí lo estaban.
Confirmación de la asociación
entre FMRP-mRNP y los ARNm
identificados por microarreglos
Con
el
fin
de
demostrar
independientemente que los ARNm en la
Tabla 1 están asociados a FMRP-RNPm.
 Se
realizaron IP en presencia de
competidores:
ARNt de levadura y Heparina

No alteraron la asociación especifica
Se IP del lisado wt y KO, con una RNP
nuclear pequeña (snRNP), U1-70K con AC
anti U1-70K mAb, simultáneamente con
FMRP-RNPm.
El Ac anti U1-70K precipitó eficientemente a
este RNP del lisado wt y KO, mientras que
el AC anti FMRP el mAb 7G1-1 solo lo
precipita a este del wt como era esperado.
Western blot
Izq: IP con Ac anti U1-70K y revelado con AC anti proteína U1-70K.
Der: IP con AC anti FMRP 7G1 y revelado con AC anti 1C3 de FMRP
Lysate : lisado total
Paréntesis : Ac
El ARN recuperado de cada
precipitación fue purificado y
analizado por RT-PCR.


Se realiza este ensayo con 8 ARNm
previamente identificados, como
enriquecidos en las IP de MicroArrays del
wild type.
También para un set de ARNm no
enriquecidos por la IP del wild type en los
ensayos de MicroArrays.
RNP:
ARNm:
ENRIQUECIDOS
en MicroArrays
Electroforesis en PAGE de los productos de RT-PCR.
Tot. ARN: ARN total de cerebro de ratón (0.1µg).
U1: IP anti U1-70K
F: IP anti FMRP
Izq: marcador de peso molecular
NO
ENRIQUECIDO
Para confirmar los datos del microarreglo, se
realizó LightCycler RT-PCR cuantitativo (PCR
en tiempo real) del IP-wt y el lisado total wt.
El
LightCycler
permite
la
automatización
de
la
PCR,
cuantificando en tiempo real la
amplificación de una secuencia
blanco, mediante el uso de curvas
estándar.
El fundamento de esta tecnología
la utilización de aire para el ciclo
calentamiento-enfriamiento al que
someten las muestras durante
corrida.
es
de
se
la
La cuantificación de los productos
amplificados se realiza utilizando un
micro-fluorímetro acoplado al aparato.
En
una
corrida
normal,
20
milisegundos son suficientes para
medir una muestra.


Se realiza un análisis de LightCycler
RT-PCR cuantitativo a 3 ARNm que
no se encontraban enriquecidos en el
wt-IP en relación con el input-IP.
Simultáneamente se realiza este
ensayo a 3 ARNm enriquecidos en el
wt-IP en relación con el input-IP.
Verificación de los datos de
microarreglos usando LightCycler
Real-Time PCR
NO enriquecido
Enriquecido
En la tabla 2 se ve que de 3 ARNm testados que no se encontraron enriquecidos en los
microarreglos de wt-IP, todos presentaron un pequeño incremento luego la RT-PCR.
Por otro lado, tres genes que si estaban enriquecidos en los microarreglos de wt-IP
relativo al lisado total, se vieron altamente enriquecidos en el IP luego de la RT-PCR.
Estos resultados confirman los resultados de los microarreglos.
Perfiles polirribosomales alterados
de ARNm en ausencia de FMRP



Se quiere definir algún atributo funcional
de esta asociación.
Se realiza centrifugación en gradiente de
sacarosa, que separa los ARNm según su
asociación relativa a los ribosomas.
Se busca observar cambios en los perfiles
de la fracción de polirribosomas para un
sub-set de ARNm.
Espectro
de
Absorción
Fracción
Polirribosomas
.


Con las fracciones 9 a 11, se preparo
ARNc para hibridar en Microarreglos.
Se comparo perfiles de ARNm de
fracciones polirribosomales de cepa
normal y con Fragile-X.
Dendrograma de genes
con cambios significativos
en los perfiles de la
fracción polirribosomal de
las células Genes que
están presentes en mayor
nivel están representados
con color rojo aquellos que
presentan menor presencia
frente al paciente se ven en
verde aquellos con igual
representación se ven en.
FMR1 gen,
se ve en
menor intensidad tanto en
la fracción total como en
las
fracciones
poli
ribosómicas
Para confirmar mas
los datos, se examinó
las distribuciones de
NAP- 22 y MKPX en
fracciones frescas de
gradiente de sacarosa
por Northern blot




Ambos disminuyeron en las fracciones
polirribosomales de las células de Fragil X,
aunque no hubo diferencia en el Arn
citoplasmático total.
Se revela un cambio más notable en el
perfil traduccional de las células Fragil X
GADPH fue el control, no mostrando
diferencias a lo largo del graciente.
Se confirma el cambio selectivo en el perfil
traduccional de un subgrupo de ARNm en
ausencia de FMRP
DISCUSIÓN



Diversos estudios han caracterizado el
comportamiento de unión al ARN de FMRP .
Aquí se identifica el repertorio de ARNs
asociados in vivo con el complejo endógeno
FMRP.
Se muestran los cambios del perfil
traduccional en ausencia de FMRP
Identificaión a gran escala de
ARNm asociados a FMRP-mRNP



Se encontró que el complejo FMRP-mRNP se
relaciona con el 4% de los genes expresados en
el cerebro de ratón.
Mensaje de Fmr1:no está entre estos mensajes
a pesar que estudios in vitro muestran la
asociación de FMRP con su propio ARNm.
Se detectó a nivel moderado en el lisado
cerebral del wt (diferencia de 144 con imput) y
no se detectó (como se esperaba) en el lisado
imput-KO.


En comparación, 32% de los genes
expresados tienen intensidades de señal
mayor que la de FMr1 en el lisado imput.
Incremento moderado de 4,2 veces en el
transcripto FMR1 al comparar el ARN-wt-IP
con el ARN-KO-IP, pero no se encontró
enriquecimiento al compara el ARN-wt-IP
con el ARN-wt-input


Aunque el transcripto Fmr1 podría ser un ligando
de FMRP, según los datos presentados, es probable
que hayan otros mensajeros con mayor avidez para
el complejo mRNP.
En contraste con Fmr1, otros ARNm fueron
detectados a nivele muy bajos en el lisado de
cerebro wt input, mientras que estaban
enriquecidos en el complejo FMRP-mRNP.
KIAA0561-like protein
Prot. De intercambio GDP/GTP Rab 3
Celera ARNm hCT25324


RT-PCR cuantitativo LightCycler confirmó que
el grupo de transcriptos que se enriquecieron
en los datos de microarreglos también
estaban de 30 a 60 veces enriquecidos en el
wt-IP en comparación con el lisado input
(incluye transcriptos de tabla 1)
Presencia de falsos negativos
Ejemplo: caso del transcripto NAP-22
Transcripto NAP-22




Microarreglo Mu 19K: Enriquecido en wt IP
Microarreglo MG-U74: No se detectó
Muestra un cambio en su perfil
traduccional en ausencia de FMRP
El RT-PCR cuantitativo mostró que se
enriquecía 63 veces en el wt-IP en relación
con el lisado de cerebro total.


El microarreglo MG-U74 presenta distintos
oligonucleotidos que los de Mu 19K, es
probable que los dos estén evaluando
distintas isoformas o distintos miembros
de la familia de algunos genes.
Esta discrepancia, junto con el alto nivel
de rigurosidad utilizado en el análisis,
sugiere que podrían haber subestimado el
número de transcriptos asociados con
FMRP-mRNP
Asociación polorribosómica alterada
de ARNm`s en ausencia de FMRP


H. FMRP es incorporada al complejo mRNP con
sus ARNm`s ligados asociándose con
polirribosomas traductores modulando la
traducción de los ARNm ligados.
Microarreglo: Identificaron un grupo de ARNm
alterados en la fracción polirribosomal de alto
PM en células X-fragil
Esto podría implicar una
alteración en la regulación de la
traducción en ausencia de FMRP
ARNm´s especificos de FMRP y
estructura de cuarteto de G´s
Encontraron que sólo el 2% de los genes
expresados testeados mostraron un
cambio en el perfil traduccional en
ausencia de FMRP.
Problemas.
1) IP a partir de lisado de cerebro de ratón
(Ac 7G1-1)
2) Estudios en células humanas no
cerebrales.



Existen limitaciones al comparar los sets de
datos debido a expresión tejido-especifico
y a microarreglos especie-específicos.
Sin embargo, los datos respaldan la idea de
que los complejos FMRP-mmRNP
reconocen ARNm específicos y regulan su
traducción.


H: Las proteínas de unión al ARN en los
complejos interactúan con elementos de
regulación en cis específicos dentro de un grupo
de ARNm, esto permite que los transcriptos sean
regulados a nivel post-transcripcional.
Tienen que existir elementos estructural
comunes entre el grupo de ARNm encontrados
en los complejos FMRP-mRNP.
Cuarteto de G`s
Estas observaciones indican que la estructura de
cuarteto de G`s es relevante desde el punto de
vista biológico en el síndrome de x frágil.
ARNm`s ligados a FMRP y
patogénesis del síndrome x frágil.
Seria sólo un pequeño grupo de ARNm`s
( los de mayor afinidad con FMRP) los que se
ven influenciados por la ausencia de FMRP.

Consecuencias de la ausencia de
FMRP.

Efecto tisular sutil: afecta regiones de
síntesis localizada de proteínas (procesos
neuronales), transcriptos reportados
codifican proteínas involucradas en
función neuronal.
DESAFÍOS


Determinar cual de los ARNm candidatos
es más critico en el síndrome X frágil.
Fenotipo X frágil y otros trastornos
neuropsiquiatricos: los ARNm identificados
aquí deben ser considerados como genes
candidatos también en otros trastornos.
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Microarray Identification de FMRP