ELECTROFORESIS
Cuál de los siguientes enunciados es verdadero?
•
La velocidad que adquiere una partícula que porta una
determinada q es proporcional al E aplicado.
•
La me de una proteína es directamente proporcional a la Mr e
inversamente proporcional a la q.
•
La FEO es proporcional al E aplicado en el sistema.
•
En un fraccionamiento electroforético de proteínas de suero
humano, el poder resolutivo del agar resulta mayor que el de
una membrana de acetato de celulosa gelificado.
•
La FEO es siempre indeseable en el desarrollo de las distintas
técnicas electroforéticas.
•
El desarrollo de calor es siempre indeseable en electroforesis.
•
La movilidad de una partícula en electroforesis es
directamente proporcional a la fuerza iónica del medio.
Rango de separación de fragmentos de DNA en
geles de agarosa o poliacrilamida
Agarosa %
0,3
0,6
0,7
1,2
2,0
Acrilamida %
3,5
5
12
15
20
Intervalo de tamaños
(bp)
5.000 - 60.000
1.000 - 20.000
800 - 10.000
400 - 6.000
100 - 2.000
Intervalo de tamaños
(bp)
1000 - 2000
80 - 500
40 - 200
25 - 150
6 - 100
ELECTROFORESIS EN GEL
DE POLIACRILAMIDA
ESTRUCTURA DE LA MATRIZ DEL GEL DE
POLIACRILAMIDA
Copolimerización de los monómeros de acrilamida y N,N’- metilenbisacrilamida
PAGE. POLIMERIZACION
Reacción de catálisis por radicales libres:
• Iniciador: persulfato de amonio
•
Catalizador o propagador de la reacción: TEMED (N,N, N’, N’tetrametilendiamina (acelera la formación de radicales libres del
iniciador)
S2O82- + e-  SO42- + SO4-• (R•)
R• + M  RM•
RM• + M  RMM • , etc
• Iniciador: riboflavina + UV (reacción fotoquímica) 
•
generación de R•
TEMED no es imprescindible pero favorece la reacción
PAGE. POLIMERIZACION
• MONÓMEROS NEUROTÓXICOS!!
• Inhibición de la polimerización: oxígeno (bloqueo de
R• iniciados por persulfato), pH ácido retarda la
polimerización (presencia de ácido acrílico por
hidrólisis)
• Luz y oxígeno: requeridos cuando se usa riboflavina
• Ajuste de la velocidad de polimerización (tiempo):
cantidades óptimas de persulfato y TEMED
• Temperatura: óptima 25-30°C (a < 10°C: gel
inhomogéneo, a 50°C: polímeros cortos)
PAGE: POROSIDAD DEL GEL
T%yC%
•T = (Acrilamida + Bisacrilamida) % (p/v)
•C = Bisacrilamida / (Acrilamida + Bisacrilamida) % (p/p)
T y C influyen sobre el grado de reticulación (tamaño
de poro), resistencia mecánica, fragilidad y elasticidad
del gel
•T < 4%: geles casi fluidos (agregar agarosa 0,5%)
•T > 25% ó C > 10%: geles opacos y quebradizos
T (C 1%)
3-5%
7 - 10 %
15 - 20 %
Poro
70 nm
10 nm
5 nm
kDa
> 150
40-100
< 10
Consideraciones prácticas
• Polimerización de los
monómeros activada por la
luz
• TEMED: sensible a la acción
de la luz
• Evitar presencia de ácido
acrílico (hidrólisis de
acrilamida)
• Persulfato de amonio:
hidratación del sólido e
inestabilidad de las soluciones
• Conservar las soluciones en
botellas oscuras a resguardo
de la luz
• Agregar a la solución stock
resina de intercambio
aniónico (Amberlite IRA-400,
Dowex1 ó 2)
• Preparar soluciones frescas.
Conservar el persulfato sólido
en desecador y las soluciones
a -20°C
ELECTROFORESIS
Efecto de la carga eléctrica y el tamaño molecular
GELES DE POLIACRILAMIDA
VENTAJAS
 Tamiz molecular: tamaño de poro variable
 Químicamente inerte frente a moléculas biológicas
 Transparente, facilidad para ser densitometrado
 Estable en amplio intervalo de pH, fuerza iónica y temperatura
 Resistente a agentes desnaturalizante
 Fuerza electroendosmótica reducida
 Mecánicamente estable
 Fácil de almacenar
 Amplia versatilidad para la detección de compuestos analizados
DESVENTAJAS
 Toxicidad de los monómeros
 El material no puede ser recuperado
PAGE
•CILINDRO (ROD) - PAGE VERTICAL
Tamaño variable. Siembra única. Dificultad para estandarizar.
PAGE preparativa. Facilidad para PAGE en sistema multifásico de
buffers. Equipo especial.
•PLACA (SLAB) - PAGE HORIZONTAL
Espesor variable. Siembra múltiple y en distintas zonas del
gel. Equipo común para otros sistemas electroforéticos.
•PLACA (SLAB) - PAGE VERTICAL
Espesor variable. Siembra múltiple. Sentido único de
electroforesis. Facilidad para PAGE en sistema multifásico
de buffers. Equipo especial. Ventaja en estandarización del
proceso.
PAGE
•SISTEMA HOMOGENEO DE GEL Y pH
•SISTEMA DE GEL DISCONTINUO
Caso especial: gel con gradiente de poro
•SISTEMA MULTIFÁSICO DE BUFFERS
(concentración de la muestra)
•CONDICIONES NATIVAS
•CONDICIONES DESNATURALIZANTES
(ruptura de agregados, disociación en subunidades, solubilización). Posible
alteración de actividad biológica, enzimática, inmunológica.
 Urea 6-8 M (agregada a muestra y gel): ruptura de puentes de H
 Detergentes no iónicos (Tritón X-100, Tween 20) o glicerol (70%)
 2-mercaptoetanol o DTT (reducción de -S-S-): agregados a la
muestra. No agregar al gel: inhibición de polimerización.
Detergentes (aniónico SDS, catiónicos BCTA o CPC)
DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS
MOLECULARES.
I.-DIAGRAMA DE FERGUSON
•
•
log m = log m0 - KRT
log Rf = log Y0 - KRT
1) PAGE de proteína X y 7
log m
log Rf
proteínas estándar en 5 geles
con diferentes T%
2) Para cada proteína: gráfico de
log Rf vs. %T
3) Para cada proteína, cálculo de
KR (pendiente de la curva)
%T
Mr
4) Gráfico de Mr (estándar) vs. KR
5) Mr de proteína X por
interpolación del KR
KR
PAGE - GRADIENTE DE PORO
DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS
MOLECULARES.
II.-PAGE EN GRADIENTE DE PORO
•
•
•
•
Gradiente adecuado a los
componentes de la
muestra: 4-16, 4-24, 4-30
A
log PM
Sistema multifásico de
buffers
Inclusión de marcadores de
tamaño molecular
(características similares a
las de las proteínas en
estudio)
Curva de calibración:
tamaño molecular vs. D
recorrida o T alcanzada
D1/2
B
log Mr
log T
DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS MOLECULARES.
III.- SDS-PAGE
• Combinación de la proteínas con SDS para
enmascarar las cargas (tratamiento de la muestra)
• Agregado de SDS a la muestra y al buffer de los
compartimientos electródicos
• Elección del T% del gel de separación de acuerdo
con el tamaño de los compuestos a analizar
• Inclusión de marcadores de tamaño molecular
(características similares a las de las proteínas en
estudio)
• Electroforesis
• Curva de calibración: tamaño molecular vs. distancia
recorrida
SDS- PAGE: curva de calibración y
determinación de tamaños moleculares
SDS-PAGE
EFECTO DE AGENTES DESNATURALIZANTES
GELES DE POLIACRILAMIDA
APLICACIONES
 DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS MOLECULARES
 ESTUDIOS DE HETEROGENEIDAD MOLECULAR (VARIANTES
GENÉTICAS)
 INTERACCIONES (AGREGACIÓN, DISOCIACIÓN)
 INTERACCIONES (LIGANDO-RECEPTOR)
 IDENTIFICACIÓN (REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO)
 ESTRUCTURA (PROTEÍNAS OLIGOMÉRICAS, PUENTES
DISULFUROS)
 MODIFICACIONES POTTRDUCCIONALES (GLICOSILACIÓN,
FOSFORILACIÓN)
 ISOENZIMAS
Rango de separación de fragmentos de DNA en
geles de agarosa o poliacrilamida
Agarosa %
0,3
0,6
0,7
1,2
2,0
Acrilamida %
3,5
5
12
15
20
Intervalo de tamaños
(bp)
5.000 - 60.000
1.000 - 20.000
800 - 10.000
400 - 6.000
100 - 2.000
Intervalo de tamaños
(bp)
1000 - 2000
80 - 500
40 - 200
25 - 150
6 - 100
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ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA