Criterios de evaluación primera versión del
informe largo



Título:Qué se hizo (1.5 ptos.)
Dónde se hizo (1.5 ptos.)
Resumen: Objetivo (1 pto.)
Métodología breve (1 pto.)
Resultados breves (1 pto.)
Conclusión (1 pto.)
Introducción: Información consultada (2 ptos.)
Citas de la información consultada (1 pto.)
Hipótesis (1 pto.)
Objetivo (1 pto.)
Criterios de evaluación primera versión del
informe largo



Materiales y métodos: Que este narrado en pasado (0.5 ptos.)
Que este narrado en forma de párrafo (0.5 ptos.)
Dónde y cuándo se hizo el experimento (1 pto.)
Que describa detalladamente cómo se hizo (3 ptos.)
Resultados: Párrafo hablando de los resultados (2 ptos.)
Gráficas con título explicativo y número (1.5 ptos.)
Tablas con título explicativo y número (1.5 ptos.)
Discusión: Discusión del por qué de los resultados, ayudándose de
información consultada (2 ptos.)
Citas de la información consultada (1 pto.)
Conclusión (2 ptos.)
Criterios de evaluación primera versión del
informe largo

Literatura citada (3 ptos)
Los criterios serán los mismos para la segunda versión, pero los puntajes
cambiarán porque ésta vale 20 PUNTOS. Sin embargo, tenga en cuenta,
que en la primera versión fui más flexible, prácticamente sólo tuve en
cuenta que estuvieran todos los componentes, pero en la segunda versión
voy a revisar que se hagan todos los cambios sugeridos y que se esfuerce
por mejorar, sobre todo la DISCUSIÓN.
Entregue la segunda versión grapada con la primera.
PONDRÉ UN REPASO PARA EL EXAMEN A MÁS TARDAR EL
VIERNES 18 DE NOVIEMBRE EN EL SAC
Actividades próximas semanas
Entrega de segunda versión del informe por parte de los estudiantes y
entrega de notas parciales por parte de la instructora:

Sección 040: El lunes 21 de noviembre de 11:30 a 12:30 am.

Secciones 067 y 071: Martes 22 de noviembre de 2:00 a 4:00 pm.

Todas las secciones pueden ir a esas horas para despejar dudas del parcial
(23 de noviembre).
La nota final del laboratorio se entregará, el miércoles 30 de noviembre de
11:00 a 12:00 am y el jueves 1 de diciembre de 2:00 a 4:00 pm
Biología molecular
Marcela Bernal Múnera
BIOL 3051L
Laboratorio
12
Objetivos
Analizar el ADN
Conocer los principios básicos de la técnica de
electroforesis y su aplicación al análisis del
ADN.
Describir las funciones de las enzimas de
restricción.
Introducción
•
El material genético de organismos tan diferentes como las aves y
las bacterias muestra algunas similitudes.
• La biología molecular estudia el ADN y los genes que contiene.
• La biología molecular es una herramienta para estudiar relaciones
evolutivas entre los organismos. También tiene aplicaciones en la
agricultura y la medicina.
• El cortar el ADN con enzimas de restricción es frecuentemente
el primer paso para estudiar un gen.
Enzimas de restricción
 Las enzimas de restricción, también conocidas como
endonucleasas, se extraen de bacterias, donde actúan como
mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que
entre en la célula.
 Son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material
genético a partir de una secuencia de bases nitrogenadas que
reconocen.
La mayoría de estas secuencias son palindrómicas (secuencias que
se leen igual en ambas direcciones).
“Dábale arroz a la zorra el abad”
Enzimas de restricción
Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII y
EcoRI, como todas las enzimas de restricción, toman el
nombre de las bacterias que la producen:
EcoRI: E = género Escherichia.
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Enzimas de restricción
Existen 3 tipos de enzimas de restricción:
1. Tipo I y Tipo III:
a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las
Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento. Las Tipo
III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que
reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA,
desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
Enzimas de restricción
2. Tipo II:
a. Sólo tienen actividad de restricción.
b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la
secuencia que reconocen.
c. Sólo requieren Mg++ como cofactor.
d. No necesitan ATP.
Corte de las enzimas de restricción
Cohesivos o
pegajosos: Cortan la
doble hebra de ADN
de manera escalonada
en dos puntos
diferentes.
Abruptos: Cortan
las dos hebras del
ADN en la misma
posición (en un sólo
punto).
Factores que afectan la actividad de
las enzimas de restricción
1. Pureza del ADN: Contaminantes como proteínas y altas
concentraciones de sal pueden inhibir la actividad de la
endonucleasa.
2. Temperatura y pH.
3. Tipo de molécula de ADN: Si el ADN no posee una
secuencia reconocida por la enzima de restricción, esta
enzima no podrá cortar el material genético.
4. Amortiguador (buffer) adecuado: Un amortiguador o
buffer provee el ambiente necesario para que la enzima
trabaje en condiciones óptimas.
Electroforesis de DNA
Luego de que el ADN es cortado con enzimas de restricción , los fragmentos
generados se analizan de varias maneras. La más común es la electroforesis.
Con esta técnica se separan macromoléculas (ej. proteínas y ácidos nucleicos) a
través de un flujo de corriente eléctrico.
Los fragmentos de ADN se separan a través de la electroforesis de acuerdo a
las siguientes características:
El tamaño de la molécula o masa.
La forma o conformación del ADN (ej. ADN súper-enrollado vs. ADN lineal).
El tamaño de los poros del gel.
La magnitud de la carga neta de la molécula.
Características de los geles comúnmente
usados en electroforesis
AGAROSA
POLIACRILAMIDA
1. Polisacárido extraído de
algas.
1.
Los geles de poliacrilamida
son generados al mezclarse
polímeros de acrilamida y
bisacrilamida.
2. No tóxico.
2. Tóxico.
3. Se puede variar el tamaño de 3. El tamaño de los poros
los poros ajustando la
depende de la concentración
concentración de agarosa.
de acrilamida y bisacrilamida.
4. Separa fragmentos de ADN
de 200 a 50,000 pb.
4. Usado para fragmentos de
ADN de menos de 500 pb.
5. Usado para separar mezclas
de proteínas.
Electroforesis de DNA
Cuando
moléculas
cargadas son colocadas en
un campo eléctrico, éstas
migran hacia el polo
positivo (ánodo) o polo
negativo
(cátodo)
de
acuerdo a su carga.
La carga neta del ADN es
negativa (por la presencia
de los grupos fosfatos), lo
que hace que migre del
cátodo al ánodo.
Electroforesis de DNA
Los fragmentos de DNA migrarán a una razón inversamente proporcional al
logaritmo de su tamaño o peso molecular.
 A mayor tamaño menor será la migración del fragmento y a menor tamaño
mayor será la migración del fragmento.
 El movimiento de los fragmentos de DNA va a producir un patrón de
bandas, donde cada banda corresponde a un fragmento de un tamaño
particular.
 El tamaño de cada fragmento puede ser determinado utilizando un
marcador o una escalera de DNA cuyos fragmentos tienen pesos moleculares
conocidos.
 Este marcador sirve de control y migrará paralelo a las bandas de DNA que
deseamos analizar.
Electroforesis de DNA
 Los fragmentos de DNA que han sido separados
por electroforesis se pueden analizar posteriormente
con otras técnicas, comparar diferentes organismos o
ser insertados en genomas de otros organismos para
crear un ADN recombinante. Este es el principio
utilizado para crear organismos transgénicos y la
manipulación genética que ha producido gran
impacto en la medicina y en la agricultura
Ejercicio 1. Práctica de uso de
micropipetas
1. Escoge un plato Petri ya preparado con gel solidificado;
este gel ya debería tener unas fosas.
2. Escoge una micropipeta y apoye el brazo que esté
agarrando la micropipeta en una superficie firme.
3. Utilice la mano contraria para apoyar la micropipeta.
4. Con su micropipeta, obtenga un poco de la mezcla (de
agua, glicerina y tinte azul).
5. Introduzca la punta de la micropipeta dentro de la fosa, sin
tocar el gel.
Ejercicio 1. Práctica de uso de
micropipetas
6. Vierta el contenido en
la fosa, presionando el
botón de la pipeta
hasta el primer punto
de resistencia.
7.
Practique
procedimiento
veces.
este
varias
Ejercicio 2. Preparación de las
digestiones de ADN
1. Para preparar el ADN:
a) Añada 100 µL de agua destilada a un microtubo con ADN y deje a
temperatura ambiente por 5 minutos.
b.) Agítelo y manténgalo en hielo o en una nevera mientras se usa.
2. Para preparar las digestiones:
a) Rotule 4 microtubos de 1-4: El 1 tiene ADN con enzima de
restricción EcoRI,
El 2 tiene ADN con enzima de restricción BamHI, el 3 tiene ADN
con enzima de restricción HindIII y el 4 tiene ADN sin cortar (sin
enzima de restricción)
b) A cada microtubo, añada agua destilada, el amortiguador y el ADN (en
esta secuencia) con las cantidades señaladas en la siguiente tabla.
Ejercicio 2. Preparación de las
digestiones de ADN
Preparaciones de muestras de ADN
Tubo 1:
EcoRI
Tubo 2:
BamHI
Tubo 3:
HindIII
Tubo 4:
ADN sin
cortar
Agua destilada
7 µL
7 µL
7 µL
8 µL
*Amortiguador
1 µL
1 µL
1 µL
1 µL
ADN
1 µL
1 µL
1 µL
1 µL
Enzima de
restricción
1 µL
1 µL
1 µL
No aplica
Volumen total
10 µL
10 µL
10 µL
10 µL
* En la mayoría de los casos, la enzima de restricción viene preparada con el
amortiguador (buffer) que le corresponde.
Ejercicio 2. Preparación de las
digestiones de ADN
c) Añada cada enzima de restricción (vea Tabla) a su
respectivo microtubo (excepto al microtubo número 4, ya
que éste no lleva enzima) y agite los ingredientes para cada
tubo con la punta de su respectiva micropipeta.
Nota: El volumen total para cada microtubo es 10 µL.
d) Incube cada mezcla a 37º C por una hora.
Ejercicio 3.1. Preparación del gel
para la electroforesis.
1. Prepare su bandeja de electroforesis primero y luego el gel de
agarosa.
2. Suba las tapas de los lados de la bandeja para tapar esa sección
y evitar que se pierda el gel.
3. Coloque la peinilla en la bandeja de electroforesis. La bandeja
tiene unas “guías” que indican donde colocar la peinilla. De
no ser así, coloque la peinilla a 1 cm del borde.
Ejercicio 3.1. Preparación del gel
para la electroforesis.
4. Mezcle 1 g de agarosa
con 100 mL de TBE 1X
en un frasco
Erlenmeyer limpio y
caliéntelo en una
hornilla (hotplate).
Use guantes resistentes al
calor
Ejercicio 3.1. Preparación del gel
para la electroforesis.
5. Agite girando la mezcla de vez en cuando. Cuando empiece a
burbujear, y aclare, agite constantemente hasta que hierva y se vean
burbujas en la superficie.
6. Asegúrese que toda la agarosa se ha disuelto.
7. Remueva de la hornilla y deje enfriar hasta que lo pueda agarrar sin
quemarse.
8. Vierta la mezcla en la bandeja de electroforesis empezando en una
esquina y rompa las burbujas con una aguja de disección.
9. Deje que se solidifique el gel y coloque la bandeja en un lugar
seguro para que no se contamine.
Ejercicio 3.1. Preparación del gel
para la electroforesis.
Ejercicio 3.2. Corrida del gel para
la electroforesis.
1. A cada microtubo incubado (del Ejercicio b), añada 2 µL de
tinte (loading dye). El volumen total de cada uno es ahora 12
µL.
Nota: El tinte (loading dye) que se utiliza contiene bromofenol
azul y glicerol. El bromofenol azul es un tinte que se usa para
observar en la corrida por donde va el ADN, y el glicerol le da
peso a la muestra evitando así que ésta se salga de la fosa.
2. Con el gel ya solidificado, ponga la bandeja en la cámara de
manera que las fosas queden en el lado negativo (cátodo).
Esto asegura que las muestras migren del cátodo (atrae cargas
– ) hacia el ánodo (atrae cargas +).
Ejercicio 3.2. Corrida del gel para
la electroforesis.
3. Añada suficiente TBE 1X hasta que se cubra el gel.
4. Espere un minuto en lo que el amortiguador entra a las fosas y luego remueva con
cuidado la peinilla del gel. Nota: Aunque el número de fosas creadas por la peinilla
puede variar, para este ejercicio, se utilizará solamente las primeras cinco fosas.
5. Utilizando una micropipeta, cuidadosamente coloque 12 µL del tinte (loading dye) en
la primera fosa. Para las demás muestras, coloque 12 µL en las fosas
correspondientes según la siguiente figura. Recuerde que para cada solución o
muestra, utilice una punta diferente para evitar contaminación.
T in te
(load in g d y e)
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
(E coR I)
(B am H I)
(H in d III)
Tubo 4
(A D N sin cortar)
Ejercicio 3.2. Corrida del gel para
la electroforesis.
6. Coloque la tapa sin mover la cámara (el tanque) de electroforesis.
7. Se sugiere colocar un papel oscuro debajo de la cámara antes de
servir las muestras. Esto le ayudará a percatarse por dónde están
migrando las bandas.
8. Para correr el gel:
a.) Conecte la cámara a una fuente de energía (power supply) y
encienda el aparato a una razón de 10V por cada cm del gel (se
correrá a aproximadamente 80 voltios).
Ejercicio 3.2. Corrida del gel para
la electroforesis.
b) Asegúrese que el aparato esté leyendo en voltímetros y NO en miliamperios.
c) Verifique que vea burbujas formándose en el amortiguador, y que NO se esté
calentando.
d) Verifique el voltaje para que no suba y ajuste de ser necesario.
e) Deje migrar las muestras hasta que la línea del tinte se encuentre a
aproximadamente un centímetro y medio del extremo positivo.
f) Apague el equipo.
Luego de que termina la electroforesis, el ADN se tiñe para revelar los
patrones de bandas formados en el gel que corresponden a fragmentos de
diferentes tamaños
Ejercicio 3.2. Corrida del gel para
la electroforesis.
9. Para teñir el gel.
a) Saque su gel y colóquelo en la bandeja de tinción.
b) Cubra el gel con tinte (loading dye).
c)
Deje por media hora, y agite de vez en cuando.
d.) Saque el gel usando guantes desechables (para no teñir sus manos) y colóquelo en
agua para lavar hasta que destiña bastante. NO BOTE EL TINTE. El mismo se
reusará.
e) Saque el gel y colóquelo en el iluminador.
f) Observe su gel y prepare un diagrama de lo que se observa, señalando las distintas
bandas.
g) Descarte el gel en el recipiente correspondiente.
Ejercicio 3.2. Corrida del gel para
la electroforesis.
a) Cubriendo el gel con tinte.
c) Ejemplo de un gel iluminado.
b) Colocando el gel en el iluminador.
Ejemplo de una electroforesis
Resultados luego de
teñir:



A: marcador con
pedazos de tamaño
conocidos.
B: Lamda cortado
con Eco R1.
C: Lamda sin cortar.
Dibuje sus resultados
(–)
1
2
3
4
(+ )
5
6
1. ¿Cuántos cortes o
fragmentos fueron
producidos por cada enzima
de restricción?
2. Compare sus resultados con
información que encuentra en
la Internet. Por ejemplo,
¿cuántos fragmentos
normalmente se producen
por cada enzima de
restricción?
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Propiedades Generales del Sistema Inmune