TRABAJO FIN DE CARRERA
“CONTROL BIOLÓGICO DE Fusarium
oxysporum f. sp. melonis RAZA 1.2 CON
ANTAGONISTAS”.
ALUMNA: RAQUEL SOBRINO RUBIO.


DIRECTORES DEL PROYECTO:
- Mª LUISA SORIANO MARTÍN
- ANDRÉS PORRAS PIEDRA
FECHA DE PRESENTACIÓN: MAYO 2005.

IMPORTANCIA ECONÓMICA DEL
CULTIVO DEL MELÓN



PRODUCCIÓN EN
ESPAÑA DE 1 MILLÓN
DE TONELADAS
SUPERFICIE:
-75% CULTIVOS AL
AIRE LIBRE
-25% CULTIVOS
PROTEGIDOS
EN CLM90% EN
CIUDAD REAL
2
INTRODUCCIÓN A LA FUSARIOSIS
VASCULAR DEL MELÓN

condiciones de desarrollo ~20º C.

primeros trabajos sobre el estado sanitario
de los melonares de Levante y Murcia en
1976.

en 1985 se describe la micosis en cultivos
bajo plástico en Almería.
3
DIFICULTAD DE CONTROL DE LA
FUSARIOSIS VASCULAR


enfermedad muy virulenta.
reducción de la producción hasta un
90% .
4
INTRODUCCIÓN AL CONTROL
BIOLÓGICO
VENTAJAS




respetuoso con el medio
ambiente
no existen problemas de
intoxicaciones
no crea resistencia
eliminación casi completa
de la utilización de
productos fitosanitarios
INCONVENIENTES




ignorancia sobre su
utilización
falta de apoyo económico
falta de personal
especializado
enemigos naturales
susceptibles a productos
fitosanitarios
5
INTRODUCCIÓN A LOS
MICROORGANISMOS ANTAGONISTAS
1. ocurre con frecuencia en la naturaleza.
2. interacción continua entre patógenos
potenciales y sus antagonistas.
-equilibrio dinámico en la superficie del suelo3. microorganismos antagonistas:
- BACTERIAS: Bacillus y Pseudomonas
- HONGOS: Trichoderma y Micorrizas
Arbusculares
6
MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS
ANTAGONISTAS

Competencia: debe existir “escasez” de un elemento. La
competencia más común es por nutrientes, oxígeno o espacio.

Interacción directa con el patógeno:
-Parasitismo: un microorganismo parasita a otro.
- Predación: el antagonista se alimenta de materia orgánica
entre la cual ocasionalmente se encuentra el patógeno.

Antibiosis y lisis: inhibición del crecimiento de un
organismo por la acción de una sustancia producida por otro
organismo.
7
OBJETIVOS
1. ESTUDIAR EL POSIBLE ANTAGONISMO FRENTE A
Fom MEDIANTE ENFRENTAMIENTO DUAL IN VITRO
2. DETERMINAR LA EFICACIA DE LOS ORGANISMOS
SELECCIONADOS EN EL CONTROL BIOLÓGICO DE
Fom RAZA 1.2 EN PLÁNTULAS DE MELÓN
3. DETERMINAR LA EFICACIA DE LA COLONIZACIÓN DE
LAS RAÍCES DE LAS PLÁNTULAS DE MELÓN CON
MICORRIZAS VESÍCULO-ARBUSCULARES EN EL
CONTROL BIOLÓGICO DE Fom.
8
MATERIALES
Y
MÉTODOS
ANTAGONISTAS UTILIZADOS EN EL
CONTROL BIOLÓGICO







Trichoderma harzianum
Aspergillus A5, Aspergillus A8, Aspergillus
terreus, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus
Penicillum sp
Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens
Bacillus subtilis
Fusarium oxysporum no patogénicos
Glomus mosseae, Glomus intraradices, Glomus
claroideum
10
MATERIAL VEGETAL Y
PATÓGENO


SEMILLAS DE MELÓN DEL CULTIVAR
AMARILLO CANARIO F1 HÍBRIDO.
Fusarium oxysporum f. sp. melonis
RAZA 1.2 AISLADO CR 6801
11
PRODUCCIÓN DE INÓCULO DEL
PATÓGENO

REPICADO DE Fom EN
PDA.

REPICADO DE Fom EN
CPD.
- repicado del patógeno en
placas de petri con PDA.
-explante en matraz
erlenmeyer.
- estufa: 252º C, 7 días.
-agitador orbital (120
rpm), 25-27ºC, 16 horas
luz, 6 días.
-filtrado del hongo.
-cuantificación de la
densidad del inóculo.
-ajuste de la concentración
de inóculo.
12
CULTIVO DUAL IN VITRO



CULTIVO DUAL  consiste en el enfrentamiento
del patógeno y el antagonista en una placa de
petri, analizando el crecimiento de ambos que se
compara con el crecimiento individual de cada
uno de ellos.
SEPARACIÓN:
- 7 cm (HONGOS)
- 5 cm (BACTERIAS)
ENSAYO: 3 PLACAS DE PETRI, 4 REPETICIONES
TESTIGOS DE PATÓGENO
TESTIGOS DE ANTAGONISTA
13
CULTIVO DUAL DE Fom Raza 1.2
CON Trichoderma harzianum

pequeña cantidad del preparado de T.
harzianum con pinzas esterilizadas en
una placa de petri con PDA.

enfrentamiento de explantes de 5 mm de
diámetro de Fom y T. harzianum.


placa de petri en estufa (27ºC).
mediciones del diámetro de las colonias
cada 48 horas.
14
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON
Aspergillus A5, Aspergillus A8 y
Penicillum sp.




repicado de los hongos de la placa original
en PDA.
enfrentamiento de explantes de 5 mm de
diámetro de Fom con Aspergillus y
Penicillum.
placa de petri en estufa (27ºC).
mediciones del diámetro de las colonias
cada 48 horas.
15
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON
Aspergillus terreus, A. flavus y A.
ochraceus.




recuperación de los hongos
liofilizados.
enfrentamiento de explantes de 5
mm de diámetro de Fom y
Aspergillus.
placa de petri en estufa (27ºC).
mediciones del diámetro de las
colonias cada 48 horas.
16
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON
Pseudomonas fluorescens y
Pseudomonas putida.
1. recuperación de las bacterias liofilizadas.
2. ensayo en: PDA y AGAR NUTRITIVO
3. enfrentamiento de explantes de 5 mm de
diámetro de Fom y Pseudomonas en Agar
Nutritivo (separación de 5 cm).
4. placa de petri en estufa (27ºC)
5. mediciones del diámetro de las colonias cada
48 horas
17
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2
CON Bacillus subtilis.
ENSAYO CONTENIENDO EXUDADO DE
ENSAYO EN PDA
Bacillus subtilis.
- ENFRENTAMIENTO DE
EXPLANTES DE 5 mm DE
DIÁMETRO DE Fom Y Bacillus
subtilis EN PDA (SEPARACIÓN
DE 5 CM).
-
-
5 EXPLANTES DE 5 mm.
-
MATRAZ ERLENMEYER CON CPD.
-
AGITADOR ORBITAL (120 rpm, 7 DÍAS,
TOTAL OSCURIDAD, TEMPERATURA
AMBIENTE).
- PLACA DE PETRI EN ESTUFA
(27ºC)
- MEDICIONES DEL DIÁMETRO
DE LAS COLONIAS CADA 48
HORAS.
ENSAYO CON EXUDADOS DE Bacillus
subtilis.
-
COMPROBACIÓN DEL CRECIMIENTO.
-
SE AÑADE AGAR.
-
EXPLANTE DE Fom.
-
COMPROBACIÓN DEL DIÁMETRO DE LA
COLONIA DE FOM CADA 48 HORAS. 18
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2
CON Fo NO PATOGÉNICO




repicado de los hongos de la placa original
en PDA
enfrentamiento de explantes de 5 mm de
diámetro de Fom con Fo NO PATOGÉNICO.
placa de petri en estufa (27ºC)
mediciones del diámetro de las colonias
cada 48 horas
19
CONTROL BIOLÓGICO
IN VIVO
PRODUCCIÓN DE Trichoderma
harzianum
DETERMINACIÓN DE LA
DENSIDAD DE INÓCULO DEL
PREPARADO COMERCIAL
“MÉTODO DE LAS
DILUCIONES”
-
-
PDA CON NYSTANINA AL 1%.
DILUCIÓN DEL PREPARADO
COMERCIAL EN 9 ml DE AGUA.
DILUCIONES EN 6 VIALES.
PLACAS DE PETRI EN ESTUFA (27ºC)
OBSERVACIÓN DE PLACAS CADA 12
HORAS.
21
PRODUCCIÓN DE Aspergillus A5


repicado del hongo en PDA en placa de petri con
PDA (7 días,25-27ºC, oscuridad)
repicado del hongo en CPD
- 5 explantes de 5mm de diámetro en matraz de
CPD
- agitador orbital 120 rpm en cámara de
crecimiento (6 días, 25-27ºC, 16 horas de luz)

filtrado del hongo

cuantificación de la densidad de inóculo

ajuste de la concentración de inóculo
22
GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE
MELÓN



germinación en placas de petri
- capa de vermiculita
- disco papel secante esterilizado
- semillas
- disco de papel secante esterilizado
cámara de crecimiento (3 días, 2527ºC, 16 horas luz)
plantación en vasos de plástico
perforados en la base o bandejas de
alvéolos

Etiquetan y enumeran con el
antagonista utilizado.

cámara de crecimiento (12 días)
23
APLICACIÓN DE LOS ANTAGONISTAS
AL SUBSTRATO

CADA ENSAYO:
- 40 plántulas (4 repeticiones de 10 plántulas cada
una)
- 10 plántulas testigos antagonistas (control +)
- 10 plántulas testigo con inóculo del patógeno
(control -)
- 10 plántulas testigo sin tratar (control )

SUBTRATO ESTÉRIL Y SUBTRATO NO ESTÉRIL
24
SUBSTRATO


El substrato estéril se utiliza para observar el
comportamiento de los microorganismos
antagonistas y Fom sin que se encuentre
sometido a la acción de otros microorganismos
que se puedan hallar en el substrato (bacterias,
hongos, etc.).
Los ensayos en substrato no estéril se realizan
para observar el comportamiento de los
microorganismos antagonistas y Fom en las
condiciones en las que se encontrarían las
plántulas de melón en el invernadero.
25
TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON
Trichoderma harzianum






Ensayos:
a) dosis 55 gr/kg de
substrato
b) dosis 27.5 gr/kg de
substrato
Mezclar de forma
homogénea
Vasos de plástico
perforados
Bandejas de alvéolos
Semilla germinada de
melón
Cámara de crecimiento
26
TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON
Aspergillus A5





Suspensión conídica
concentración 107
conidias/ml
En 100 ml de
substrato se añaden
10 ml de suspensión
conídica
Mezcla homogénea
Semilla germinada de
melón
Cámara de
crecimiento
27
TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON
MICORRIZAS



En 150 ml de
substrato se añade
una cucharilla de
café rasa del
preparado
micorrízico
Semilla de melón
germinada
Cámara de
crecimiento
28
INOCULACIÓN DE LAS PLÁNTULAS DE
MELÓN CON EL PATÓGENO



Suspensión de 5 x 105 conidias/ml
de Fom Raza 1.2
Se añaden 10 ml de suspensión a
cada vaso que contiene las plántulas
de melón.
Cámara de crecimiento
29
REAISLAMIENTO DEL
PATÓGENO EN PDA.
REAISLAMIENTO 
siembra en PDA de
fragmentos de raíz,
cuello y tallo
(desinfestados) para
comprobar si el
patógeno ha sido
capaz de colonizar el
sistema vascular de
las plantas tratadas
con antagonistas e
inoculadas con Fom
30
CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE
MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS
PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON
MICORRIZAS ARBUSCULARES.






Con el microscopio se realizan
observaciones verticales en el
porta-objetos tomando como
referencia una distancia
constante de 0.2 mm, y se
anotan en 100 intersecciones si
están o no micorrizadas.



A los 30 días del tratamiento.
3 plantas por ensayo
Lavado de raíces
Fragmentos de 2-3 cm
Decoloración de raíces con KOH al
10%, temperatura ambiente
Lavado y acidificación con CLH
0.1N durante 30 minutos.
Tinción con Azul Tripán (4 horas)
Intervalos de 15 min, lavado con
agua
Colocación de fragmentos en un
porta-objetos de forma paralela 31
EVALUACIÓN DE LA INCIDENCIA Y
SEVERIDAD DE LA ENFERMEDAD
ESCALA DE SEVERIDAD
0 0% PLANTA SANA
1 0-10% SÍNTOMAS LEVES
2 10-50% SÍNTOMAS
SEVEROS
3 50-75% SÍNTOMAS MUY
SEVEROS
4 >75% PLANTA MUERTA
32
RESULTADOS
1. RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO
DUAL IN VITRO

-
-
Finalización del ensayo:
Unión física entre las colonias de
antagonista y patógeno
Halo de separación constante
durante varias mediciones
34
RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO
DUAL IN VITRO
Halo de inhibición entre el patógeno y
Aspergillus A5
35
DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD DE
INÓCULO DEL PREPARADO COMERCIAL
DE Trichoderma harzianum


conteo a las 48 horas de
realizarse las diluciones
- incontables
- placas dilución -6
contables
resultado total 16.6 x 107
u.f.c en el paquete original
de Trichoderma harzianum
36
RESULTADO DEL CONTROL BIOLÓGICO
IN VIVO
5
ÍNDICE DE SEVERIDAD
ÍNDICE DE SEVERIDAD
5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Nº DE DÍAS DESPUÉS DE LA INOCULACIÓN
Trichoderma harzianum
Testigo Fom
22
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
16
18
20
22
Nº DE DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN
Trichoderma harzianum
Curva de progreso de la enfermedad
tras infectar las plantas con el patógeno
(testigo control -) y comparación con los
valores medios del ensayo utilizando
como antagonista Trichoderma
harzianum dosis 55 g/kg substrato
estéril.
14
Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patógeno (testigo
control -) y comparación con los valores
medios del ensayo utilizando como
antagonista Trichoderma harzianum dosis
55 g/Kg substrato no estéril.
37
RESULTADO DEL CONTROL BIOLÓGICO
IN VIVO
ÍNDICE DE SEVERIDAD
ÍNDICE DE SEVERIDAD
5
4
3
2
1
5
4
3
2
1
0
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Nº DE DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN
Nº DE DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN
Trichoderma harzianum
Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patógeno
(testigo control -) y comparación con los
valores medios del ensayo utilizando
como antagonista Trichoderma harzianum
dosis 55 g/kg substrato estéril
Trichoderma harzianum
Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patógeno
(testigo control -) y comparación con los
valores medios del ensayo utilizando como
antagonista Trichoderma harzianum dosis
27.5 g/kg substrato estéril.
(transplante).
38
RESULTADO DEL CONTROL BIOLÓGICO
IN VIVO
ÍNDICE DE SEVERIDAD
ÍNDICE DE SEVERIDAD
5
4
3
2
1
5
4
3
2
1
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Nº DE DÍAS DESPUES DE LA INOCULACIÓN
Trichoderma harzianum
Tesigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patógeno (testigo
control -) y comparación con los valores medios
del ensayo utilizando como antagonista
Trichoderma harzianum dosis 27.5 g/Kg
substrato no estéril.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Nº DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN
Trichoderma harzianum
Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patógeno (testigo
control -) y comparación con los valores
medios del ensayo utilizando como
antagonista Trichoderma harzianum dosis
27.5 g/Kg substrato estéril, transplante.
39
22
RESULTADO DEL CONTROL BIOLÓGICO
IN VIVO
ÍNDICE DE SEVERIDAD
ÍNDICE DE SEVERIDAD
5
4
3
2
1
5
4
3
2
1
0
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Nº DE DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN
Nº DE DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN
Aspergillus A-5
Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patógeno
(testigo control -) y comparación con los
valores medios del ensayo utilizando como
antagonista Aspergillus A-5.
Glomus mosseae
Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patógeno (testigo
control -) y comparación con los valores
medios del ensayo utilizando como
antagonista Glomus mosseae.
40
ÍNDICE DE SEVERIDAD
ÍNDICE DE SEVERIDAD
RESULTADO DEL CONTROL BIOLÓGICO
IN VIVO
5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Nº DE DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN
Glomus intraradices
Testigo Fom
22
5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Nº DE DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN
Glomus claroideum
Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patógeno (testigo
control -) y comparación con los valores
medios del ensayo utilizando como
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patógeno (testigo
control -) y comparación con los valores
medios del ensayo utilizando como antagonista
antagonista Glomus intraradices
Glomus claroideum.
41
22
RESULTADO DEL REAISLAMIENTO DEL
PATÓGENO EN PDA
Reaislamiento del patógeno de planta tratada
con Trichoderma harzianum utilizando la
dosis recomendada (substrato no estéril)

Reaislamiento del patógeno en PDA de
plantas tratadas con Glomus intraradices
En todas las pruebas de aislamiento se dio positivo
en cuanto a infestación de las plantas por Fusarium
oxysporum f. sp. Melonis.
42
REAISLAMIENTO DEL
PATÓGENO EN PDA
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
R
55 gr/kg (SE)
C
55 gr/kg (SNE)
TB
TM
27,5 gr/kr (SE)
TA
27,5 gr/kg (SNE)
Porcentajes de reaislamiento de Fom en explantes
de plantas tratadas con distintas dosis de
Trichoderma harzianum, en substrato estéril (SE)
y no estéril (SNE), procedentes de explantes de
raíz (R), cuello (C), tallo bajo (TB), tallo medio
(TM) y tallo alto (TA).
43
REAISLAMIENTO DEL
PATÓGENO EN PDA
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
R
Glomus mosseae
C
TB
Glomus intraradices
TM
TA
Glomus claroideum
Porcentajes de reaislamiento de Fom en explantes de
plantas tratadas con Micorrizas Arbusculares, en sustrato
estéril (SE), procedentes de explantes de raíz (R), cuello
(C), tallo bajo (TB), tallo medio (TM) y tallo alto (TA).
44
3. RESULTADO DEL CÁLCULO DEL PORCENTAJE
DE MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS
PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON M.A.
Los porcentajes de raíz
micorrizada obtenidos
son los siguientes:
- Glomus intraradices:
10’12 %
- Glomus mosseae:
10’41 %
- Glomus claroideum:
10’23 %
20
PORCENTAJE DE
MICORRIZACIÓN

15
10
5
0
Glomus mosseae
Glomus intraradices
Glomus claroideum
Resultado del cálculo del porcentaje
de micorrización de las raíces de las
plántulas de melón tratadas con
micorrizas.
45
RESULTADO DEL CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE
MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS
PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON M.A.
Observación de la micorriza por el microscopio,
donde se aprecian vesículas dentro de la raíz.
46
4. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
ÍNDICE DE
SEVERIDAD
5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Nº DE DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN
Trichoderma harzianum 55 g/kg Substrato estéril
Trichoderma harzianum 55 g/kg Substrato no estéril
Trichoderma harzianum 55g/kg de substrato( transplante)
Trichoderma harzianum 27,5 g/kg Substrato estéril
Trichoderma harzianum 27,5g/kg de substrato no estéril
Trichoderma harzianum 27,5 g/kg Substrato estéril (transplante)
Aspergillus spp. Substrato estéril
Glomus mosseae Substrato estéril
Glomus intraradices Substrato estéril
Glomus Claroideum Substrato estéril
Testigos de Fusarium oxysporum f. sp. melonis ( substrato estéril)
Comparativa de las diferentes curvas de progreso de
47
la enfermedad de los ensayos realizados
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS


En los diferentes ensayos realizados, se ha
podido observar que las plántulas de melón
tratadas con Trichoderma harzianum (55 gr/kg
substrato estéril) y Glomus claroideum, han
conseguido retardar el proceso de infección del
patógeno Fom raza 1.2 en 8 días, siendo la media
de los demás ensayos de 5,8 días.
Se ha comprobado de igual forma que tras el
reaislamiento del patógeno en PDA en todos los
ensayos realizados, éste se ha desplazado de
forma sistémica por toda la plántula produciendo
la muerte.
48
5. RESULTADO DEL ANÁLISIS
ESTADÍSTICO


ANOVA Table: En los ensayos realizados
no hubo diferencias significativas entre las
variables, con un 95% de nivel de
confianza.
MULTIPLE RANGE TESTS: En los ensayos
realizados no hubo diferencias
significativas entre los pares de datos, con
un 95% de nivel de confianza.
49
CONCLUSIONES


Los microorganismos que han resultado demostrar
su eficacia antagonista ante el patógeno Fusarium
oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en el control
biológico in vitro tras realizarse los experimentos
han sido: Trichoderma harzianum y Aspergillus A5.
En los ensayos realizados, se ha comprobado que
la inoculación con Trichoderma harzianum
(empleando la dosis de 55 gr/kg como 27.5 gr/kg)
estimuló el crecimiento de las plántulas de melón.
50
CONCLUSIONES


Ningún hongo o bacteria que se ha utilizado en
este proyecto ha dado como resultado un control
total de Fusarium oxysporum f. sp. melonis, si
bien se ha demostrado que los hongos
Trichoderma harzianum (dosis 55 gr/Kg de
substrato estéril) y Glomus claroideum ha
retardado la aparición de los síntomas del hongo
patógeno sobre las plántulas que se han tratado.
Los porcentajes de micorrización de las raíces de
las plántulas de melón tratadas con Micorrizas
Arbusculares (MA) han sido bajos, alrededor de
un 10 %, debido a esto su eficacia como
microorganismo antagonista no ha sido efectivo
51
FINAL
PRESENTACIÓN
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PROYECTO - Universidad de Castilla